張 輝，張娜娜，馬 麗，唐 堅(jiān)，喬勇進(jìn)*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；3.上 海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

響應(yīng)面法優(yōu)化大麥苗葉綠素提取工藝

張 輝1,2，張娜娜3，馬 麗1，唐 堅(jiān)3，喬勇進(jìn)2,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；3.上 海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

為優(yōu)化大麥苗葉綠素的提取工藝，試驗(yàn)以乙醇-水為溶劑對(duì)大麥苗葉綠素進(jìn)行浸漬提取。采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素，通過(guò)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明：液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間是影響葉綠素提取量的顯著因素。優(yōu)化所得最佳提取工藝參數(shù)為液料比31∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)92%、提取時(shí)間112 min。 在此條件下，葉綠素提取量為13.622 mg/g，與預(yù)測(cè)值13.646 mg/g較一致。故響應(yīng)面法可用于優(yōu)化大麥苗葉綠素的提取工藝，且其優(yōu)化工藝參數(shù)可為大麥苗葉綠素工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)；中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)；大麥苗葉綠素；提取工藝優(yōu)化

大麥嫩苗因富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營(yíng)養(yǎng)成分，其資源的開發(fā)、利用已逐漸受到廣泛關(guān)注，如麥綠素、麥汁等相關(guān)產(chǎn)品的研制[1-2]。葉綠素屬卟啉類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、消炎、預(yù)防癌癥等多種生理功能[3]。葉綠素及其衍生物作為天然色素在食品、醫(yī)藥及日用化工領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[4]。此外，隨著對(duì)葉綠素生理功能研究的不斷深入，以葉綠素為主要原料的功能性食品種類及數(shù)量也逐漸增多[5-6]。目前，天然葉綠素主要提取原料為蠶沙[7]、菠菜[8]及生物土壤結(jié)皮[9]等。以大麥苗為原料進(jìn)行葉綠素定向提取并對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化的研究未見報(bào)道。大麥苗因其原料具有種植周期短、成本低、產(chǎn)量大及易加工等優(yōu)點(diǎn)，可作為葉綠素提取的優(yōu)選原料。Castle等[10]通過(guò)研究丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亞砜對(duì)生物土壤結(jié)皮葉綠素a的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙醇和二甲基亞砜的雙萃取具有較好的提取效果。也有研究表明乙醇-丙酮的混合溶液因具有協(xié)萃作用，從而得到更高的葉綠素提取率[11]。但二甲基亞砜和丙酮均具有一定毒性，對(duì)人體具有危害性。Macías-Sánchez等[12]采用超臨界流體和微波輔助法對(duì)鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）葉綠素a進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)二者均優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑浸提法。但超臨界流體萃取、微波輔助提取等新興物理提取技術(shù)均存在投資成本高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等缺陷。本實(shí)驗(yàn)以乙醇-水為提取溶劑，對(duì)大麥苗進(jìn)行常溫浸漬提取，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），探討了提取大麥苗葉綠素的顯著影響因素及其最佳工藝條件，以期為拓寬葉綠素提取原料的來(lái)源，進(jìn)一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗葉綠素規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六葉期大麥苗（品種：大中88-91），采收于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田；無(wú)水乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultrospec 3300 pro紫外分光光度計(jì) 美國(guó)安瑪西亞公司；D37520 Osterode 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Biofuge公司；KK29E-18T1型冰箱 德國(guó)Siemens公司；BP301S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；FW-400A高速粉碎機(jī)、ZHWY-2102C雙層恒溫?fù)u床 上海智成分析儀器制造有限公司；Modul YOD-230真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo Savant公司。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素提取工藝流程

大麥苗鮮樣→挑選、清洗、瀝干→真空冷凍干燥（預(yù)凍溫度：－45 ℃；冷阱溫度：－37 ℃；升華溫度：25 ℃；真空度：170 Pa）→粉碎（100目）→浸提→過(guò)濾→減壓濃縮成膏狀（水浴溫度：30 ℃；真空度：110 Pa）。

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)因子水平及編碼值Table1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman experimental design

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù)從多因素系統(tǒng)中篩選出顯著的影響因素[13]。根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和搖床轉(zhuǎn)速共6個(gè)因素和5個(gè)虛擬變量為試驗(yàn)因子，篩選影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素。所有因子均設(shè)高（＋）、低（－）兩個(gè)水平，共12次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。其中虛擬變量的設(shè)計(jì)用于估計(jì)試驗(yàn)總體偏差。

1.3.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取時(shí)間為試驗(yàn)因子，采用3因素5水平，20次試驗(yàn)的CCD對(duì)大麥苗葉綠素提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)按隨機(jī)順序進(jìn)行。因子水平編碼表見表2。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可建立二次非線性回歸模型，式（1）[14]。

式中：Y為葉綠素提取量預(yù)測(cè)值；Xi、Xj為試驗(yàn)因素的編碼值；β0、βii、βij為截距及回歸常數(shù)；其中，式中Xi為無(wú)量綱的編碼值，xi為變量i的實(shí)際值，xi0為變量i的零水平實(shí)際值。Δxi為變量i的步長(zhǎng)實(shí)際值，即編碼值變化一個(gè)單位所對(duì)應(yīng)的實(shí)際變化值。

采用F檢驗(yàn)考察回歸模型顯著性；最小二乘法估計(jì) 回歸模型系數(shù)，t檢驗(yàn)法分析模型系數(shù)顯著性。因子貢獻(xiàn)率采用式（2）計(jì)算[15]：

式中：SSj為因子平方和；SST為模型總平方和。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼水平Table2 Coded levels for independent variables used in central composite experimental design

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

將干燥后的大麥苗用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。稱取樣品約2.00 g置于250 mL錐形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液提取溶劑，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以一定轉(zhuǎn)速恒溫?fù)u晃浸提，提取完成后將提取液10 ℃、10 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中，采用紫外分光光度法測(cè)定葉綠素含量[16]；葉綠素提取量采用式（3）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Y為大麥苗葉綠素提取量/（mg/g）；m為提取液中葉綠素含量/（mg/mL）；M為提取樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Plack ett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Minitab 16.0，CCD試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Desi gn-Expert 8.0.6.1、SAS 9.2，Origin 8.0繪制主效應(yīng)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值Table3 Plackett-Burman design matrix and responses

對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果采用Lenth[17]法識(shí)別顯著效應(yīng)，得到了因素標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的半正態(tài)概率效應(yīng)圖（圖1a）以及因素標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的帕累托圖（圖1b）。由圖1a可看出，因素x1、x2、x3的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)點(diǎn)離擬合線較遠(yuǎn)，位于圖右側(cè)偏上，故其為顯著影響因素（P＜0.05），即影響大麥苗葉綠素提取率的顯著因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間。其他因素標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)點(diǎn)均較小且接近零，為不顯著影響因素（P＞0.05）。標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的帕累托圖（圖1b）進(jìn)一步確定了效應(yīng)的量值和重要性。此外，其還表明所有因素均為正效應(yīng)因素。對(duì)于影響葉綠素提取量不顯著的因素，在后續(xù)試驗(yàn)中均維持其在低水平，以減少資源浪費(fèi)。

圖1 葉綠素提取量的顯著影響因素Fig.1 Factors having a significant influence on chlorophyll extraction yield

2.2 CCD試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

本試驗(yàn)共設(shè)20次試驗(yàn)，其中包括8次全因子試驗(yàn)、6次星號(hào)點(diǎn)試驗(yàn)及6個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，取其平均值作為響應(yīng)值。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。

表4 CCD設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值Table4 Central Composite Design matrix and responses

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并建立三元二次回歸方程式（4）：

2.2.2 回歸模型的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

表5 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of significance test for the fitted regression model

由表5可知，判定系數(shù)（R2）為0.993 8說(shuō)明模型相關(guān)性較好，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值有較大影響。校正判定系數(shù)（）為0.988 1，表明98.81%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋。變異系數(shù)（variation coefficient，CV）為0.67%，表示試驗(yàn)的可信度和精確度較好。精密度是有效信號(hào)與噪音的比值，其值大于4.0視為合理，本試驗(yàn)精密度為43.923，表明其為一個(gè)適宜的信號(hào)。模型F值為176.86，表明其達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間等全部解釋變量對(duì)被解釋變量的共同影響具有差異極顯著性，且模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。此外，失擬項(xiàng)F值為1.273 6（P＝0.398 6＞0.05），表明失擬值和純誤差沒(méi)有顯著性關(guān)系，即回歸模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域不失擬。

表6 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果及置信區(qū)間Table6 Significance test results and confidence interval of coefficients of the regression model

回歸模型系數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，各一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X2X3均對(duì)葉綠素提取量影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)葉綠素提取率影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。此外，回歸模型各項(xiàng)系數(shù)的置信區(qū)間均較窄，說(shuō)明模型系數(shù)值離真實(shí)值較近，其精確度高。綜上可知，該模型能用于指導(dǎo)試驗(yàn)。

2.3 模型效應(yīng)分析

2.3.1 主效應(yīng)分析

由于模型存在交互效應(yīng)，故不宜用回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小來(lái)直接比較二次項(xiàng)、交互項(xiàng)作用的大小。因此，本試驗(yàn)均采用因子貢獻(xiàn)率來(lái)衡量各因子對(duì)葉綠素提取量的影響大小。圖2表明，一次項(xiàng)效應(yīng)＞二次項(xiàng)效應(yīng)＞交互項(xiàng)效應(yīng)。模型各項(xiàng)間乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次效應(yīng)影響最顯著，其次是其一次項(xiàng)效應(yīng)，而液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)葉綠素提取率影響最小。3個(gè)試驗(yàn)因素的效應(yīng)大小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間。

圖2 因子貢獻(xiàn)率Fig.2 Percentage contributions of factors

2.3.2 單因素效應(yīng)分析

將回歸模型（式4）中的兩個(gè)因素固定在零水平，得到液料比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3）的單因素模型，分別為式（5）～（7）。在－1～＋1水平間可得到各因子的單因素軌跡圖（圖3）。

圖3 單因素軌跡圖Fig.3 Perturbation of single factors

由圖3可看出，各因子對(duì)葉綠素提取量的影響趨勢(shì)，并可由曲線的走向及彎曲程度看出各因子與響應(yīng)值的關(guān)系。增加液料比，傳質(zhì)動(dòng)力增加，有助于葉綠素溶出，故前期響應(yīng)值增加較快。但液料比大于25∶1后，大麥苗中葉綠素已基本溶出，而呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)。葉綠素提取量伴隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的變化均呈下開口拋物線趨勢(shì)，但二者的上升、下降幅度不同，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)變化幅度較大，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葉綠素提取量影響較大。

2.3.3 兩因素效應(yīng)分析

圖4 葉綠素提取量響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for chlorophyll extraction yield

由圖4a可知，葉綠素的提取量隨液料比的增加呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)而后增長(zhǎng)緩慢的趨勢(shì)。增加液料比可增加傳質(zhì)動(dòng)力，有助于葉綠素的溶出，但當(dāng)液料比達(dá)到一定程度時(shí)，已溶出大部分葉綠素，若再增加液料比，則葉綠素提取量增加緩慢。圖4b表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葉綠素提取率的影響較顯著，表現(xiàn)為其曲線較陡。此外，由其還可看出，葉綠素提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這可能是由于乙醇極性較弱，體積分?jǐn)?shù)增大減小了提取液極性，使其更接近于葉綠素的極性，從而增加了葉綠素的溶出。但由于部分葉綠素是以和蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在于植物細(xì)胞中，故乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)減少此部分的葉綠素溶出。液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖為橢圓形狀，表明二者交互效應(yīng)顯著，與方差分析結(jié)果一致。最優(yōu)點(diǎn)較接近于液料比為30∶1和乙醇體積分?jǐn)?shù)為92%處，并在這兩點(diǎn)附近達(dá)到最大值。此外，還可看出，葉綠素提取量對(duì)液 料比的變化比對(duì)提取時(shí)間變化更為敏感。圖4c表明葉綠素提取率隨提取乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大和提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且二者有明顯的交互作用。

2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗(yàn)證

規(guī)范分析[18]能求出響應(yīng)面的拐點(diǎn)并判斷其類型（最大值點(diǎn)、最小值點(diǎn)、馬鞍形點(diǎn)）。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行規(guī)范分析（表7），得到葉綠素提取的一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)，該點(diǎn)處理論響應(yīng)值為13.646。由于特征值均為遠(yuǎn)離零值的負(fù)數(shù)，且穩(wěn)定點(diǎn)在可試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)，故一般認(rèn)為此穩(wěn)定點(diǎn)為最大值點(diǎn)，無(wú)需進(jìn)行嶺脊分析。考慮到實(shí)際工作的便利，將浸提工藝修正為液料比31∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)92%、提取時(shí)間112 min。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得葉綠素提取量為13.622 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值相差不大。此外，其顯著高于已報(bào)道的其他植物葉綠素提取含量，如桑葉[19]（5.376 mg/g，干質(zhì)量）、蠶沙[7]（2.68 mg/g，干質(zhì)量）等。范燕青等[20]以水為溶劑，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在提取溫度25 ℃、時(shí)間2 h、料液質(zhì)量比1∶3、提取次數(shù)2次的工藝條件下得到的大麥苗葉綠素提取量為12.80 mg/g，低于本實(shí)驗(yàn)工藝條件下的結(jié)果。這可能是因?yàn)槿~綠素極性較弱，在水溶液中較難滲出。此外響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠探尋出試驗(yàn)因素在整個(gè)區(qū)域水平中的最佳參數(shù)組合，克服了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能給出試驗(yàn)因素在設(shè)定水平下的最佳組合的缺陷，從而得到了較高的葉綠素提取率。陳紹瑗等[19]采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的桑葉葉綠素提取的最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間5.25 h、提取溫度56.5 ℃、液料比103∶1。其工藝參數(shù)值均高于本研究工藝參數(shù)值。這可能是由于桑葉原料細(xì)胞壁較為堅(jiān)硬，且其原料破碎程度較小造成。

表7 規(guī)范分析結(jié)果Table7 Results of canonical analysis

3 結(jié) 論

通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)，篩選出影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間，并通過(guò)CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了顯著影響因素與大麥苗葉綠素提取量之間的三元二次回歸模型，確定了大麥苗葉綠素最佳提取工藝參數(shù)為液料比31∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)92%、提取時(shí)間112 min，在此工藝條件下，葉綠素提取量為13.622 mg/g，其與預(yù)測(cè)值13.646 mg/g基本一致。故該模型能反映大麥苗葉綠素提取過(guò)程中的內(nèi)部規(guī)律，可較好地預(yù)測(cè)大麥苗葉綠素的提取情況，并能為拓寬葉綠素提取原料的來(lái)源、進(jìn)一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗葉綠素工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

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Optimization of Extraction Process for Chlorophyll from Young Barley Grasses Based on Response Surface Methodology

ZHANG Hui1,2, ZHANG Na-na3, MA Li1, TANG Jian3, QIAO Yong-jin2,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Agricultural Products Storage and Processing Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201403, China; 3. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The extraction of chlorophyll from young barley grasses with aqueous ethanol as extraction solvent was optimized. Significant variables that influence extraction efficiency were selected by Plackett-Burman experimen tal design and optimized by central composite experimental design. Solid-to-solvent ratio, ethanol concentration and extraction time were identified as main influencing parameters. The optimal extraction condition s were fo und to be 31:1, 92% and 112 min. Under these conditions, the observed yield of chlorophyll was 13.646 mg/g, approximating to the predicted value of 13.622 mg/g. It can be concluded that response surface methodology is applicable to optimize the parameters for extraction of chlorophyll from young barley grasses and the optimized extraction process parameters can provide a reference for industrial production of chlorophyll from young barley grasses.

Plackett-Burman design; central composite design; chlorophyll of young barley grasses; optimization of extraction process

R284.2

A

1002-6630（2014）02-0075-06

10.7506/spkx1002-6630-201402014

2013-05-09

上海市科委國(guó)際合作計(jì)劃項(xiàng)目（073907003）

張輝（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工。E-mail：nd_zh@sina.com

*通信作者：?jiǎn)逃逻M(jìn)（1967—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工。E-mail：yjqiao2002@126.com