丁 琳，張玉林，楊 媛，趙紫微，潘道東*

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化浙東白鵝皮膠原蛋白提取條件

丁 琳，張玉林，楊 媛，趙紫微，潘道東*

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

以浙東白鵝皮為對象，探討酸種類、pH值、料液比及提取時間對膠原蛋白提取率的影響，先確定酸的種類，然后在單因素試驗分析的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明：最佳提取工藝為酸種類乳酸、pH 1.9、料液比1∶50（g/mL）、提取時間60 h。在此條件下，鵝皮膠原蛋白提取率達(dá)到30.12%，與理論預(yù)測值相比相對偏差為0.13%。經(jīng)紫外光譜推斷為典型的Ⅰ型膠原蛋白，紅外光譜分析可得出其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

鵝皮；膠原蛋白；乳酸；響應(yīng)曲面

膠原又稱膠原蛋白，主要存在于動物的皮、骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了27種類型的膠原蛋白[1]。膠原是生皮中最主要的纖維蛋白，在真皮蛋白質(zhì)中，膠原占85%～90%[2]。我國鵝飼養(yǎng)量占到世界的90%左右[3]，浙東白鵝是中國著名地方良種，鵝皮中脂肪含量極高，膠原纖維層約占皮張總厚度的1/35～1/20[4]，所以除脂后的鵝皮可以成為膠原蛋白的良好來源，但迄今尚未有利用鵝皮提膠原蛋白的研究。

目前酶提膠原蛋白的方法研究較多，但酶解完成后需高溫滅酶，高溫會引起膠原蛋白變性，如王哲平等[5]發(fā)現(xiàn)經(jīng)40 ℃熱處理后刺參膠原蛋白的一級和二級結(jié)構(gòu)遭破壞；楊霞等[6]研究表明驢皮酸溶性和酶溶性膠原蛋白的熱收縮溫度分別是50.90 ℃和65.33 ℃。酸法能夠保證整個提取過程在低溫中進行，而且相對酶法更經(jīng)濟有效，陳麗麗等[7]優(yōu)化酸提鮰魚皮膠原蛋白后提取率達(dá)到62.05%。本研究優(yōu)化酸提鵝皮膠原蛋白的方法，并用紫外光譜和傅里葉變換紅外線光譜[8]分析出其膠原蛋白的類型，旨在為膠原蛋白的開發(fā)利用促進浙江養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝皮 市售鵝剝?nèi)　?/p>

透析袋（14 000 kD）；檸檬酸、乳酸、醋酸、石油醚、丙酮、乙醚、異丙醇、丁醇、氫氧化鈉、氯化鈉、氯胺T、高氯酸、對二甲基苯甲醛均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D高速分離器 寧波新芝生物科技有限公司；恒溫磁力攪拌機 上海滬西分析儀器場；臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；UV-4802紫外-可見分光光度計 尤尼坷（上海）儀器有限公司；冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；精密酸度計、AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TM500型數(shù)字控溫電熱套 海寧市華星儀器場；Bruker Tensor 27傅里葉紅外光譜儀 德國Billerica公司。

1.3 方法

1.3.1 鵝皮基本成分測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分含量的測定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗蛋白質(zhì)含量的測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪含量的測定：參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 提取工藝流程

鵝皮→修整、剪碎→脫脂→脫雜蛋白→酸提→鹽析純化→凍干

1.3.3 處理

由于膠原蛋白易變性，所以實驗操作都低于10 ℃進行[9]。

脫脂：將鵝皮以1∶10（g/mL）的比例分別置于丙酮、石油醚、乙醚、10%（V/V）異丙醇、10%（V/V）丁醇5種脫脂劑中脫脂24 h，測出脫脂前后鵝皮中的脂肪含量，確定最佳的脫脂劑。脂肪殘留量（殘油率）按公式（1）計算：

脫雜蛋白[10]：選取上述脫脂效果最好的一組繼續(xù)脫雜蛋白，在m（鵝皮）∶V（0.1 mol/L NaOH）=1∶20條件下連續(xù)攪拌6 h，再用2.5% NaCl連續(xù)攪拌6 h，處理完畢后用雙蒸水洗滌2次。

鹽析純化[11]：向粗制液中加入NaCl固體并不停攪拌，使?jié)舛冗_(dá)到2 mol/L，然后在4 ℃冰箱中靜置過夜，離心，沉淀用酸復(fù)溶后在雙蒸水中透析2～3 d。

1.3.4 提取劑的選擇

在4 ℃、料液比1∶40（g/mL）、提取時間24 h條件下，選用醋酸、乳酸、檸檬酸3種酸為提取劑，考察不同酸對膠原蛋白提取率的影響。

1.3.5 膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗

固定4 ℃、料液比1∶40（g/mL）、提取時間24 h、pH 1.9條件，分別考察pH值（1.5、1.7、1.9、2.1、2.3、2.5）[12]、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、提取時間（24、36、48、60、72、84 h）對膠原蛋白提取率的影響。

1.3.5.2 響應(yīng)曲面試驗

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼Table1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken experimental dessiiggnn

采用Design-Expert 7.0軟件，并依據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以膠原蛋白的提取率為響應(yīng)值，選取pH值、液料比、提取時間這3個因素在3個水平上進行響應(yīng)曲面試驗。共計17組，其中5個為中心點試驗。

1.3.6 膠原蛋白提取率的計算

采用羥脯氨酸法測定膠原蛋白，參照文獻[13]繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品膠原蛋白含量的測定：準(zhǔn)確稱取樣品5 mg于具塞試管中，加入3 mol/L硫酸3 mL，用電熱套130 ℃水解4 h，水解完成后純水定容到100 mL，濾紙過濾，收集濾液于錐形瓶中，取濾液4 mL用對二甲氨基苯甲醛顯色，于波長558 nm處比色測定，測得3個吸光度求平均值，根據(jù)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到水解液中的羥脯氨酸含量，再乘以14.2，得到提取物中膠原蛋白的含量[14]，膠原蛋白提取率見式（2），膠原蛋白純度見式（3）。

1.3.7 膠原蛋白的紫外光譜分析

將純化后的的膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L乳酸溶液中，配成1 g/L的膠原溶液。用紫外-可見分光光度計在200～400 nm近紫外光區(qū)以120 nm/min的速率掃描測試，掃描精度為1 nm。

1.3.8 膠原蛋白的紅外光譜測定

稱取一定量干燥的KBr和膠原蛋白凍干品混合置于瑪瑙研缽中，研磨成粉末狀，裝樣，手動壓片，取出樣品，放入樣品室。采用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在4 000～500 cm－1波數(shù)處掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝皮基本成分測定

表2 鵝皮基本組成成分（濕基）Table2 Proximate composition of goose skin (on a wet basis)

由表2可知，鵝皮中脂肪含量相對于其他動物皮（豬皮、魷魚皮等）高[15-16]，脂肪會影響所提取膠原蛋白的品質(zhì)，同時可能使蛋白有異味，所以除脂這個步驟比較關(guān)鍵；其次，鵝皮中粗蛋白含量占鵝皮干基的49.38%，膠原蛋白含量占粗蛋白的66.37%，所以鵝皮可作為膠原蛋白提取的良好原料。

2.2 脫脂處理對鵝皮脂肪殘留率（殘油率）的影響

表3 不同脫脂劑處理的殘油率Table3 Residual fat content in goose skin degreased with different organic solvents

由表3可看出，5種脫脂劑處理鵝皮后，經(jīng)乙醚處理的鵝皮殘油率最低，故選擇采用乙醚除脂。

2.3 酸種類對膠原蛋白提取率的影響

圖1 3種酸在不同pH值條件下對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of 3 types of acids at different pH conditions on extraction yield of collagen

根據(jù)圖1，相同pH值條件下，乳酸溶液對膠原蛋白的提取效果較好，且當(dāng)乳酸pH值為1.9時，提取效果最好，提取率為27.45%。另外，由于配制相同體積、相同pH值的提取液時，乳酸需要量相對比較少；可以避免價格高帶來的成本損耗，進而可以適用于工業(yè)化生產(chǎn)。綜上所述，從這3種酸中選出乳酸作為鵝皮膠原蛋白的提取劑，優(yōu)化乳酸提取膠原蛋白的條件。

2.4 乳酸提取膠原蛋白的單因素試驗

2.4.1 pH值對膠原蛋白提取率的影響

圖2 pH值對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction yield of collagen

由圖2可知，4 ℃、料液比1∶40（g/mL）、提取時間24 h條件下，pH＜1.5時膠原蛋白提取率較低，可能是由于膠原蛋白變性導(dǎo)致提取率下降。隨著乳酸pH值的增大，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)逐漸增大后減小的趨勢，因此確定最佳pH值為1.9，此時提取率為27.47%。

2.4.2 料液比對膠原蛋白提取率的影響

圖3 料液比對膠原蛋自提取率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of collagen

由圖3可知，4 ℃、pH 1.9、提取時間24h條件下，料液比與膠原蛋白提取率呈正相關(guān)，當(dāng)料液比小于1∶40（g/mL）時，膠原蛋白提取率升高趨于平緩，故從工業(yè)化生產(chǎn)的考慮選擇料液比為1∶40較為合適，此時，膠原蛋白提取率為27.44%。

2.4.3 提取時間對膠原蛋白提取率的影響

圖4 提取時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of collagen

由圖4可知，在4 ℃、pH 1.9、料液比1∶40條件下，在24～48 h內(nèi)，隨著提取時間的延長，膠原蛋白的提取率明顯增加，而48 h后隨著提取時間的延長，膠原蛋白提取率升高趨勢平緩，72 h后出現(xiàn)略微下降[17]。所以從經(jīng)濟和實際考慮，選定提取時間48 h較為合適，此時膠原蛋白提取率為30.06%。

2.5 膠原蛋白最佳提取工藝條件的確定

2.5.1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)曲面分析試驗，數(shù)據(jù)采用Design-Expert 7.0軟件進行分析。

通過Design-Expert 7.0數(shù)據(jù)分析軟件對表4中響應(yīng)值與各因素進行回歸擬合后，得到膠原蛋白提取率Y對乳酸溶液pH值（X1）、料液比（X2）和提取時間（X3）編碼值的二次多項回歸方程為：

表4 鵝皮膠原蛋白提取工藝響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果Table4 The experimental design and results for response surface analysis

回歸模型各項系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果和方程的方差分析結(jié)果見表5。

表5 回歸方程各項系數(shù)的顯著性檢驗和方差分析Table5 Significance test and analysis of variance for the terms in the regression model

R2=0.981，相關(guān)系數(shù)接近于1，表明該模型與實際實驗擬合較好[18]，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于鵝皮膠原蛋白提取實驗的理論預(yù)測。根據(jù)表5，模型中X2項顯著差異；極顯著差異，其余項差異均不顯著；3個因素對膠原蛋白提取率的影響依次為X3＞X2＞X1，即提取時間＞料液比＞pH值。

2.5.2 膠原蛋白提取工藝的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

由圖5～7可知，在此試驗條件下，主因素對提取率影響大小順序為：提取時間（X3）＞液料比（X2）＞pH值（X1）。且隨著料液比中提取液用量的增大和提取時間的延長，膠原蛋白的提取率均有提高；而隨著乳酸pH值的增大，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增大后減小的變化，當(dāng)乳酸pH 1.9時，膠原蛋白的提取率較高。

圖5 5 Y = = F（X1, , X2）響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高圖Fig.5 Response surface and contour plots of Y = = F(X1, , X2)

圖6 6 Y Y = F F（X1, , X3）響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高圖Fig.6 Response surface and contour plots of Y Y = F F(X1, , X3)

圖7 7 Y Y = = F（X2, , X3）響應(yīng)面立體分析圖相應(yīng)等高圖Fig.7 Response surface and contour plots of Y Y = = F(X2, , X3)

2.5.3 膠原蛋白最佳提取工藝條件的驗證實驗

利用Design-Expert 7.0軟件分析得到膠原蛋白的最佳提取條件為乳酸溶液pH 1.88、料液比1∶50（g/mL）、提取時間60 h，此時提取率可達(dá)30.16%。為驗證響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件來提取膠原蛋白，選定提取條件pH 1.9、料液比1∶50（g/mL）、提取時間60 h，實驗重復(fù)3次，實際測得的提取率為30.12%，與理論預(yù)測值相對偏差為0.13%。因此采用響應(yīng)面分析方法得到的優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

2.6 膠原蛋白的紫外光譜分析結(jié)果

圖8 鵝皮乳酸溶性膠原蛋白的紫外光譜圖Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum of lactic acid-soluble collagen from goose skin

通常，膠原蛋白的特征峰在230 nm波長附近[18]，這主要是由肽鍵C＝O的n→π躍遷所貢獻；蛋白質(zhì)中酪氨酸、苯丙氨酸的最大紫外吸收波長分別為283 nm和251 nm。從圖8可看出，乳酸浸提所得到的膠原蛋白特征吸收波長位于230 nm波長處附近，符合膠原蛋白的特性；在283 nm波長處略有吸收說明該膠原蛋白有少量芳香族氨基酸（酪氨酸等），而在251 nm波長處很少吸收，說明所提鵝皮膠原蛋白中苯丙氨酸含量較少。綜上，可以初步推斷所提取的蛋白質(zhì)為典型Ⅰ型膠原蛋白[19-21]。

2.7 膠原蛋白的紅外光譜檢測結(jié)果

從圖9可以看出，本方法所得膠原蛋白在3 417 cm－1處有吸收峰，是因為N—H鍵伸縮振動產(chǎn)生的酰胺A帶；而在1 654.9 cm－1處存在的吸收峰是酰胺Ⅰ帶的C＝O鍵伸縮振動，表明有羰基存在；1 546 cm－1處的吸收峰是酰胺Ⅱ帶的N—H鍵彎曲振動；1 200～1 400 cm－1光譜內(nèi)的吸收峰是其他蛋白所沒有的；1 240 cm－1為N—H鍵彎曲引起的酰胺Ⅲ帶的特征頻率。由此可說明此膠原蛋白存在完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)[22-23]。

圖9 乳酸法提取鵝皮膠原蛋白的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectrum of lactic acid-soluble collagen from goose skin

3 結(jié) 論

本實驗確定了酸提鵝皮膠原蛋白的最佳工藝：預(yù)處理中選用乙醚脫脂效果最好；醋酸、乳酸、檸檬酸3種酸中乳酸浸提效果最好，這與Skierka等[24]研究結(jié)果是一致的；pH 1.9、料液比1∶50（g/mL）、提取時間60 h條件下膠原蛋白提取率達(dá)到30.12%，與理論預(yù)測值相對偏差為0.13%，純度為92.01%。經(jīng)紫外光譜測定推斷此膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白；紅外光譜檢測得出其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。乳酸提取法生產(chǎn)工藝簡單[25]，提取的膠原蛋白有較高的純度，且較好的保持了其結(jié)構(gòu)和生理活性，適于工業(yè)化推廣。

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Optimization of Extraction Conditions for Collagen from Zhedong White Goose Skin by Response Surface Methodology

DING Lin, ZHANG Yu-lin, YANG Yuan, ZHAO Zi-wei, PAN Dao-dong*
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The objective of this study was to optimize the acidic extraction of collagen from Zhedong white goose (a famous local breed of Chinese geese for meat production) skin. Acid type, pH, solid-to-liquid ratio and extraction time were considered in this study. Lactic acid was selected as optimal extraction solvent. One-factor-at-a-time method and response surface methodology were designed for the optimization of extraction conditions. The maximum extraction yield of collagen was experimentally observed as 30.12% under the optimized conditions: pH 1.9, solid-to-liquid ratio (g/mL) of 1:50 and extraction time of 60 h, showing a relative deviation of 0.13% compared with the predicted value. The sample obtained was identified as type Ⅰ collagen by ultraviolet spectroscopy. Meanwhile, intact triple helix structure was also identified by infrared spectroscopy.

goose skin; collagen; lactic acid; response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630（2014）02-0056-06

10.7506/spkx1002-6630-201402011

2013-03-06

國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系基金項目（CARS-43-17）；寧波市創(chuàng)新團隊項目（2012B82017）；寧波市人事局人才基金項目（ZX2012000380）；浙江省重大科技計劃項目（2012C12016-1）

丁琳（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與貯藏工程。E-mail：yjsdinglin@163.com

*通信作者：潘道東（1964—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：daodongpan@163.com