張柯晴 呂坤聚 朱君祥

（中國人民解放軍第401醫(yī)院呼吸內(nèi)科；1青島大學醫(yī)學院，山東266000）

肺癌是目前世界上對人類健康威脅最大的惡性腫瘤之一，全球每年約有135萬人被確診為肺癌，120萬人死于肺癌［1］。雖然醫(yī)學技術(shù)有了長足發(fā)展，但肺癌患者的5年存活率并未得到明顯改善，僅為15%左右［1］，其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%－85%［2］。其根本原因在于肺癌發(fā)病機制尚不明確，臨床缺乏早期的診斷和治療手段。20世紀90年代以來，信號傳導(dǎo)通路逐漸成為腫瘤學領(lǐng)域研究的熱點。本研究應(yīng)用免疫組化的方法檢測FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達情況，以期探討三者與NSCLC分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。

材料和方法

1．標本與資料

收集2012年12月至2013年12月解放軍第四零一醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的NSCLC石蠟標本75例（標本要求：1．術(shù)前未進行過化療和（或）放療者；2．無合并其他器官原發(fā)性腫瘤者；3．組織塊石蠟包埋充分）。在75例NSCLC標本中，鱗癌42例，腺癌33例；男性60例，女性15例；最小年齡41歲，最大年齡78歲，平均年齡60．6歲。隨機選擇30例NSCLC癌旁正常組織作為對照。入選標本的組織學類型，分化程度及分期等均經(jīng)病理科醫(yī)師確診。

2．方法與試劑

石蠟包埋的組織塊經(jīng)4μm厚連續(xù)切片，采用免疫組織化學Envision二步法檢測FAK、NF－κBp65及VEGF－C在75例NSCLC及癌旁組織標本中的表達。步驟如下：切片脫蠟至水后EDTA緩沖液高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫溶液封閉，加一抗（FAK稀釋比例1∶50，NF－κBp65稀釋比例1∶200，VEGF－C為即用型）后4℃孵育過夜，加二抗37℃反應(yīng)，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片觀察。鼠抗人單克隆抗體FAK購于美國Santa Cruz公司，兔抗人多克隆抗體 NF－κBp65、兔多抗 VEGF－C及顯色試劑盒均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3．結(jié)果判斷

FAK及VEGF－C的表達主要位于胞漿，染色陽性信號顆粒呈棕黃色；NF－κBp65的表達主要位于胞核和胞漿，染色陽性信號顆粒呈棕黃色。染色強度分級標準：通過光學顯微鏡觀察無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；深褐色為3分。著色細胞百分率計分：每張切片隨機選取10個高倍視野（×400）下計數(shù)著色細胞百分比：0分為陽性細胞≤5%；1分為陽性細胞數(shù)6%～10%；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為≥76%。以兩類分數(shù)乘積進行判斷：0分為陰性，1－4分為（＋），5－8分為（＋＋），9－12分以上為（＋＋＋），（＋～＋＋＋）為陽性表達，（＋＋）和（＋＋＋）為強陽性表達。

4．統(tǒng)計分析

采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行分析。FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC癌組織中的表達與患者臨床病例特征之間的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗，三個免疫指標之間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．FAK在NSCLC和癌旁組織中的表達

FAK表達陽性為胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒（圖1A、1B），F(xiàn)AK在NSCLC組織中的陽性表達率為57．3%，顯著高于癌旁正常組織的13．3%（表1）。分析FAK與臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其與NSCLC的分化程度，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，而與其他因素無關(guān)（表2）。

2．NF－κBp65蛋白的陽性表達主要位于細胞核及細胞漿（圖2A、2B），NF－κBp65在 NSCLC和癌旁正常組織中的陽性表達率分別為85．3%和16．7%，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）（表1）。NF－κBp65蛋白表達與NSCLC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān)（P＜0．05）（表2）。

3．VEGF－C在NSCLC中的表達主要位于胞漿，陽性表達為棕黃色顆粒（圖3A、3B），在癌組織中的陽性表達率為65．3%，而在癌旁組織中表達為陰性（表1）。VEGF－C在NSCLC中高表達與腫瘤的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與患者性別和組織學類型等無關(guān)（表2）。

表1 FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC和癌旁組織的表達Table 1 Expression of FAK、NF－κBp65、VEGF－C in cancerous and adjacent tissues

表2 FAK、NF－κBp65及VEGF－C表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Table 2 The relationship between FAK、NF－κBp65、VEGF－C expression in NSCLC and clinicopathological characteristics

4．FAK、NF－κBp65和 VEGF－C在 NSCLC中表達的相關(guān)性

本實驗研究發(fā)現(xiàn)FAK和NF－κBp65在癌組織中共陽性表達41例，共陰性表達10例，NF－κBp65和VEGF－C共陽性表達43例，共陰性表達10例，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)Spearman相關(guān)分析，r值分別為0．228和0．274，P 值均小于0．05，因此 FAK 和 NF－κBp65，NF－κBp65和 VEGF－C之間分別存在正相關(guān)關(guān)系（表3，表4）。

表3 FAK、NF－κBp65在非小細胞肺癌中表達的相關(guān)性Table 3 The relationship between FAK and NF－κBp65in NSCLC

表4 NF－κBp65、VEGF－C在非小細胞肺癌中表達的相關(guān)性Table 4 The relationship between FAK and NF－κBp65in NSCLC

討 論

FAK是1992年由Hanks等從v－src轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細胞中克隆鑒定出來，因與細胞黏附關(guān)系密切，故命名為黏著斑激酶。FAK是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，分布于細胞黏著斑部位，是介導(dǎo)細胞與細胞之間，細胞與細胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要的胞內(nèi)分子，與腫瘤細胞生存、增殖、凋亡、遷移及血管生成等密切相關(guān)［3］。已有研究表明，F(xiàn)AK在多種腫瘤中高表達［4－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中FAK表達的陽性率明顯高于正常肺組織（P＜0．05），且與NSCLC分化程度有關(guān)，低分化組的陽性率高于高分化組，而腫瘤的分化程度與其侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，提示FAK在調(diào)節(jié)NSCLC的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。與Park等［4］對FAK在胃癌中的表達情況研究結(jié)果相似。

NF－κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于細胞中。NF－κB信號通路不僅具有調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等重要生理功能，而且其異常活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究證實，在癌細胞的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移的過程中，NF－κB的活性明顯增強［7－10］。本研究顯示，肺癌組織中NF－κB的陽性表達率明顯高于癌旁正常肺組織，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；說明 NF－κB的高表達與肺癌的發(fā)生有關(guān)。結(jié)果分析顯示，NF－κB的表達與NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且癌細胞分化程度越低，分期越高NF－κB表達的陽性率越高。

VEGF－C是第一個被發(fā)現(xiàn)的淋巴管生長因子，可與受體VEGFR－3結(jié)合，促進淋巴細胞增生，形成新生的淋巴管［11］。腫瘤細胞可以通過表達VEGFC誘導(dǎo)淋巴管生成而促進腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，已在動物實驗及臨床研究中得到證實［12］。抑制VEGF－C的表達可以抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，改善腫瘤治療預(yù)后［13］，進一步證明了VEGF－C在淋巴管生成及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中的作用。本研究顯示VEGF－C蛋白在肺癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，且VEGF－C蛋白陽性表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。證實非小細胞肺癌癌細胞可以表達、分泌 VEGF－C，與李杰等［14］的研究結(jié)論一致。因此，VEGF－C蛋白陽性表達預(yù)示著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性，淋巴轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。此結(jié)果提示，不同分化程度及TNM分期是腫瘤預(yù)后不同的原因。

研究證實，F(xiàn)AK可以通過FAK－PI3K信號通路在RAS的參與下激活PI3K，進而通過蛋白激酶B（即PKB）成員AKT磷酸化一系列下游分子如NF－κB，導(dǎo)致bcl－2轉(zhuǎn)錄增強［15］。本研究亦得到相似結(jié)果。已有研究證實，NF－κB和VEGF在多種腫瘤中的表達存在正相關(guān)關(guān)系，本研究雖得到與已有研究一致的結(jié)論，但仍需要大樣本實驗研究進一步證實。

綜 上 所 述，F(xiàn)AK、NF－κBp65 和 VEGF－C 在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且三者的陽性表達與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測三者在NSCLC組織中的表達，可以作為預(yù)測腫瘤惡性程度及預(yù)后的指標，為肺癌的診斷和治療提供新的思路及方法。

圖 版 說 明

圖1A 免疫組化染色肺腺癌中FAK陽性表達，DAB染色×400

圖1B 免疫組化染色FAK在癌旁組織中的表達，DAB染色×400

圖2A 免疫組化染色肺鱗癌中NF－κBp65陽性表達，DAB染色×400

圖2B 免疫組化染色NF－κBp65在癌旁組織中的表達，DAB染色×400

圖3A 免疫組化染色肺腺癌中VEGF－C陽性表達，DAB染色×400

圖3B 免疫組化染色VEGF－C在癌旁組織中的表達，DAB染色×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1AFAK positive expression in AC ×400

Fig．1BFAK expression in adjacent Lung tissue×400

Fig．2ANF－κBp65positive expression in SCC×400

Fig．2BNF－κBp65expression in adjacent Lung tissue×400

Fig．3AVEGF－C positive expression in AC×400

Fig．3BVEGF－C expression in adjacent Lung tissue×400

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