劉吉鋒 周美卓 王秀茹 李建華

（1沈陽市紅十字會醫(yī)院病理科，2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；遼寧110013）

在癌癥引起的死亡中，肺癌占首位，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）大約占84%，而NSCLC中大約15．9%發(fā)生胸腔轉(zhuǎn)移形成惡性胸腔積液，以腺癌最多，臨床分期屬于ⅢB或Ⅳ期［1］。晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC已失去手術(shù)治療的機(jī)會，臨床上以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療已經(jīng)成為治療晚期NSCLC癌癥最主要的方法。酪氨酸激酶抑制劑可用于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變NSCLC的靶向治療。

近年切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross complementation1，ERCC1）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）、核糖核苷酸還原酶（ribonucleotidereductase，RR）、Ⅲ型β微管蛋白（β－tubulin－Ⅲ，TUBB3）是被研究較多的四種耐藥基因，它們在DNA的修復(fù)、復(fù)制和細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮重要作用。已有多項臨床研究顯示：它們的表達(dá)能夠引起相應(yīng)化療藥物的抵抗，相對應(yīng)抵抗的藥物為順鉑、培美曲塞、吉西他濱和紫杉醇等［2－5］。

EGFR是廣泛存在于細(xì)胞膜上的一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶，其高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］，且它的高表達(dá)與其發(fā)生基因突變密切相關(guān)［7］，而其突變型對酪氨酸激酶抑制劑敏感。

本文通過惡性胸腔積液中肺腺癌的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，對腫瘤細(xì)胞中 EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表達(dá)情況和表達(dá)差異性性進(jìn)行分析，為晚期肺癌患者臨床化療用藥提供參考價值。

材料和方法

1．臨床樣本

收集2011到2014年沈陽市紅十字會醫(yī)院門診及病房胸腔積液，未接受過治療的112例肺腺癌患者惡性胸腔積液作為研究對象，經(jīng)細(xì)胞病理診斷及組織水平核實和免疫化學(xué)染色診斷為肺腺癌。112例中男47例，女65例，年齡從38至87歲，平均年齡為57歲。

2．液基細(xì)胞薄層檢測技術(shù)（ThinPrep Cytology Test，TCT）

收集新鮮胸水25ml左右，室溫下2000r／min離心5min，棄去上清液，加入清洗液再次離心后，棄去上清液，取底層沉淀細(xì)胞與保存液混合后，機(jī)器Thinprep5000自動制片，并進(jìn)行染色和鏡下診斷。

3．切片制備與HE染色

采用TCT常規(guī)制片，診斷后，每份標(biāo)本收集新鮮胸水200ml左右，室溫下2000r／min離心5min，取細(xì)胞沉渣，經(jīng)95%乙醇固定12h后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，HE染色后，鏡下觀察，篩選切片。

4．免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測

免疫細(xì)胞化學(xué)方法采用EnVision法。切片常規(guī)脫蠟、脫水，抗原修復(fù)均采用高溫高壓法，具體染色步驟按照試劑說明書進(jìn)行。檢測試劑盒購自福州MAIXIN＿BIO公司。

免疫化學(xué)染色結(jié)果判定：記錄各級切片中染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，分為5級：0分：染色細(xì)胞＜5%；1分：染色細(xì)胞5%－25%；2分：染色細(xì)胞25%－50%；3分：染色細(xì)胞50%－75%；4分：染色細(xì)胞＞75%。染色強(qiáng)度分為4級，0分：不顯色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：深棕色。每份切片計分＝染色細(xì)胞計數(shù)分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，所得分?jǐn)?shù)＜1分為陰性結(jié)果，反之為陽性，2－3分為弱陽性（＋），4－5分為中等強(qiáng)度陽性（＋＋），＞5分為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

5．統(tǒng)計分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，陽性率比較采用chi－square test，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)TCT鏡下初步診斷為可疑瘤細(xì)胞（如圖1A所示）。HE及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示上皮性腫瘤標(biāo)志物CK7和TTF－1表達(dá)陽性（圖1B－D）。EGFR陽性部位為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿（圖2A－C），陰性、弱陽性、中等強(qiáng)度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為0．9%（1／112）、15．2%（17／112）、40．2%（45／112）和43．7%（49／112）（表1），ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1分別表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞核和細(xì)胞漿、細(xì)胞漿、細(xì)胞漿，表達(dá)率分別為40．2%（45／112）、41．1%（46／112）、75%（84／112）和83%（93／112）（圖3A－D）（表1），在不同EGFR表達(dá)強(qiáng)度下，ERCC1、TYMS和TUBB3表達(dá)率不同且具有差異性（表2）。

表1 惡性胸腔積液中肺腺癌細(xì)胞的EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表達(dá)率Table 1 The positive expression rate of EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3and RRM1

圖1 A－B：惡性胸腔積液中肺腺癌細(xì)胞的TCT和HE染色。C－D：CK7、TTF－1在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)．（×400）Fig．1A－B：TCT and HE staining of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusionC－D：The expression of CK7、TTF－1in lung adenocarcinoma cells．（×400）

圖2 A－C：惡性胸腔積液中肺腺癌細(xì)胞的EGFR弱陽性（＋）、中等強(qiáng)度陽性（＋＋）、強(qiáng)陽性（＋＋＋）．（×400）Fig．2A－C：weakly positive expression（＋）、the positive expression（＋＋）、the strong positive expression of EGFR（＋＋＋）of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusion．（×400）

討 論

晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC已失去手術(shù)治療的機(jī)會，聯(lián)合化療成為其治療的主要方法。一線治療的化療方案包括以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療和酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療。EGFR基因突變的主要集中在19和21位點，已有研究報道：對EGFR基因突變患者使用吉非替尼或厄洛替尼，可顯著延長患者PFS，且具有良好的耐受性。同時，亞裔、女性、不吸煙及腺癌患者為 EGFR－TKI治療的優(yōu)勢人群［6］。在惡性胸腔積液中的癌細(xì)胞以腺癌居多，所以對EGFR的突變檢測具有重要意義。Guiyang等用免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究結(jié)果顯示：惡性胸腔積液中肺腺癌細(xì)胞的EGFR突變率與其陽性表達(dá)強(qiáng)度密切相關(guān)，表達(dá)越強(qiáng)其突變率越高［7］。ImIl Na等研究也顯示，具有胸腔轉(zhuǎn)移的肺癌患者具有較高的EGFR突變率［8］。在我們對112例惡性胸水中肺腺癌細(xì)胞的研究中顯示，EGFR強(qiáng)陽性表達(dá)率達(dá)43．7%，這對臨床用藥具有直接參考價值。

在晚期患者的臨床化療中，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療也是重要的一線化療方案，但耐藥的出現(xiàn)一直影響化療效果。ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1是近年報道較多的4種耐藥基因，它們的表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［9－12］。在正常的細(xì)胞中，這些基因參與DNA的合成與細(xì)胞的有絲分裂，但在在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，這些些基因的蛋白表達(dá)含量增加，一方面可以加快腫瘤細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)腫瘤的增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。另一方面可以使以這些基因為靶點的藥物失靈，產(chǎn)生耐藥性。在我們所研究的惡性胸腔積液中的肺腺癌細(xì)胞中有一定比例的4種耐藥基因的表達(dá)，且其表達(dá)率與EGFR的表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)，隨EGFR的表達(dá)強(qiáng)度的增高，有3種耐藥基因的表達(dá)率也增加。已知EGFR參與多條與癌癥相關(guān)的信號通路，影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成等［13，14］，是否也可以調(diào)節(jié)耐藥基因的表達(dá)，這需要進(jìn)一步證實。同時也意味著以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療和酪氨酸激酶抑制這兩種化療方案的使用可以根據(jù)不同的基因表達(dá)情況而進(jìn)行選擇，研究結(jié)果暗示，這兩種化療方案在某種程度上可以進(jìn)行互補(bǔ)。

近年來人們提出了針對不同患者進(jìn)行個體化治療的概念，治療方案應(yīng)該根據(jù)患者的臨床體征和腫瘤的分子生物學(xué)特征來制定，在這些具體的亞型中也許會獲得一些益處，組成癌癥完全新的本質(zhì)，并得到相一致的抗腫瘤化療。惡性胸腔積液是晚期肺癌患者常出現(xiàn)的臨床體征，并且比較易采集，如果對惡性胸腔積液進(jìn)行耐藥相關(guān)基因的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，這可以作為一種便捷的方式來檢測耐藥基因的表達(dá)情況，并以此為依據(jù)指導(dǎo)臨床用藥，進(jìn)行合理的個體化治療，對于改善患者預(yù)后、減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要實際意義。

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