姜海嬌 郭小寧 方長(zhǎng)清 祝 迪 李建華

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理教研室 沈陽(yáng)110001）

目前惡性腫瘤仍是威脅人類生存的天敵，而肺癌已成為全球發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一 ，在北美，肺癌的死亡率居各大腫瘤之首，甚至超過乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡率的總和。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率死亡率也迅速上升［1］，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的重要原因，而肺腺癌晚期時(shí)常發(fā)生胸腔轉(zhuǎn)移形成胸腔積液。在長(zhǎng)期的臨床細(xì)胞病理診斷當(dāng)中經(jīng)過大量的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察我們發(fā)現(xiàn)在肺腺癌的一些細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)有一些圍繞胞核成蔥皮狀改變的纖維樣結(jié)構(gòu)，尤以惡性胸水中的腺癌細(xì)胞為明顯。從肺腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的觀察引發(fā)了我們的一個(gè)假設(shè)：肺癌胸水中的中晚期肺腺癌細(xì)胞是不是同某些發(fā)生了纖維化的器官組織一樣發(fā)生了纖維化、膠原化而分泌膠原蛋白？

為驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞也可分泌膠原蛋白這一假設(shè)，我們利用Masson特殊染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western－blot方法檢測(cè)膠原纖維及膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況并探討其意義。

材料和方法

1．材料

（1）臨床資料 2013年1月至2013年11月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查涂片數(shù)千例篩選做過細(xì)胞包埋蠟塊的病例，所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。這些病例結(jié)合臨床病史、影像學(xué)診斷及細(xì)胞病理證實(shí)為肺腺癌的共224例，其中惡性胸水144例，支氣管肺泡灌洗液（BALF）石蠟包埋細(xì)胞標(biāo)本40例，痰石蠟包埋細(xì)胞標(biāo)本40例；另有對(duì)照24例為良性胸腔積液增生上皮石蠟包埋標(biāo)本，男性126例，女性98例，平均年齡57．56歲（89歲－22歲）。

（2）細(xì)胞沉渣標(biāo)本 經(jīng)診斷為肺腺癌的胸水、痰、肺泡灌洗液脫落細(xì)胞離心取沉渣，將沉渣轉(zhuǎn)移至EP管，放－70℃冰箱凍存；來(lái)自于胸水增生上皮沉渣的收集同上。

（3）主要試劑 羊抗人COL1A1COL3A1多克隆抗體、鼠抗人COL2A1單克隆抗體（Santa Cruze，美國(guó)），兔抗山羊、羊抗鼠二抗（北京中杉金橋），鼠抗人CK7、TTF－1、Vimentin單克隆抗體（Bio Genex，美國(guó)），S－P組化試劑盒，masson氏改良三色染料（廈門邁威生物科技有限公司）。

2．方法

（1）透射電鏡技術(shù) 對(duì)惡性胸腔積液的石蠟包埋標(biāo)本制成的超薄切片進(jìn)行透射電鏡成像觀察。

（2）Masson特殊染色 石蠟細(xì)胞學(xué)切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化；A試劑（蘇木素染色液）染色5min，鹽酸酒精分色，水洗返藍(lán)；B試劑（Masson氏改良三色染料）常溫過夜，水洗至無(wú)染料脫落；C試劑（0．2%冰醋酸溶液）洗30s；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察。

Masson特殊染色結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿或者胞膜上呈現(xiàn)亮綠色或者藍(lán)色顆粒為陽(yáng)性染色。

（3）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 石蠟包埋細(xì)胞學(xué)標(biāo)本4μm厚切片常規(guī)烤片、脫蠟、水化，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶法（Streptavidin－peroxidase，S－P）按說明書行免疫組化染色。COL1A1、COL2A1、COL3A1一抗稀釋濃度均為1∶50，二抗?jié)舛?∶500，CK7、TTF－1、Vimentin抗體均為即用型抗體。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果COL1A1 、COL2A1 、COL3A1、CK7 和 Vimentin抗體鏡下細(xì)胞胞漿或胞膜有棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色細(xì)胞；TTF－1抗體鏡下胞核有棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色細(xì)胞，切片中觀察5個(gè)高倍視野（×200），每一視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，≥5%為陽(yáng)性。

（4）Western blot技術(shù)檢測(cè)COL1A1、COL2A1和COL3A1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá) 總蛋白從收集的細(xì)胞沉渣標(biāo)本中提取，冰上超聲處理，4℃靜置孵育15min，4℃離心45min（15000r／min），提取上清，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。以每孔80μg蛋白加入8%SDS－PAGE凝膠電泳后，4℃80V下濕式電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉2h，在PVDF膜上孵育一抗（COL1A1 1∶500，COL2A1 1∶500，COL3A1 1∶500）4℃過夜，相應(yīng)二抗（1∶5000）37℃下孵育2h，作用后PVDF膜與ECL反應(yīng)顯色，以β－actin為內(nèi)參照。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，膠原纖維在肺腺癌不同細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的表達(dá)率采用卡方檢驗(yàn)，Collagen protein亞型之間的相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查和透射電鏡觀察到有纖維蔥皮樣結(jié)構(gòu)存在的腫瘤細(xì)胞均為肺腺癌細(xì)胞且有間質(zhì)細(xì)胞的特征

經(jīng)過TCT，我們?cè)谛厍环e液的惡性腫瘤細(xì)胞胞漿中觀察到一些圍繞胞核呈蔥皮樣改變的纖維樣結(jié)構(gòu)（圖1A），而在肺泡灌洗液和痰的惡性腫瘤細(xì)胞中及良性胸水增生上皮細(xì)胞中始終沒發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)（圖1B，C，D）。透射電鏡下觀察到在腫瘤細(xì)胞胞漿中可見細(xì)胞核和多量的纖維樣物質(zhì)，局部放大顯示纖維樣物質(zhì)可聚集存在。（圖2）。在細(xì)胞石蠟包埋切片的HE染色中這種結(jié)構(gòu)更加凸顯的出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中（圖3A），甚至有的腫瘤細(xì)胞核已經(jīng)消失，完全被這種膠原纖維結(jié)構(gòu)取代（圖3B），進(jìn)一步做了免疫細(xì)胞化學(xué)染色 TTF－1、CK7和 Vimentin（圖4），證實(shí)了這些腫瘤細(xì)胞均為肺腺癌細(xì)胞并且具有間質(zhì)細(xì)胞的特征。

2．膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性

（1）膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：COL1A1、COL2A1和COL3A1在肺腺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為：22．6%（38／168），5．4%（9／168），22．6%（38／168），陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞漿（圖5A，C，E），而在增生的上皮細(xì)胞中不表達(dá)（圖5B，D，F(xiàn)）．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示COL1A1、COL3A1的表達(dá)率要顯著高于COL2A1的表達(dá)率（P＝0．024），并且我們發(fā)現(xiàn) COL1A1與COL3A1的表達(dá)成正相關(guān)性（r＝0．886，P＝0．000）（表1）。

表1 COlA1、COl2A1、COl3A1陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性Table 1 The relationship between COlA1、COl2A1 and COl3A1expression

2．膠原纖維在肺腺癌的不同細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的表達(dá)情況

Masson特殊染色顯示膠原纖維在胸腔積液肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)率為59．7%（86／144），在支氣管肺泡灌洗液及痰的腺癌細(xì)胞中表達(dá)率分別為0%（0／40）、0%（0／40），在良性胸腔積液增生上皮中不表達(dá)（0／12）（表2），陽(yáng)性表達(dá)為在腫瘤細(xì)胞胞漿或胞膜內(nèi)成一種亮綠色（圖6）。

表2 膠原纖維在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況Table 2 The expression of collagen protein in lung adenocarcinoma cells

（2）Western－blot結(jié)果

Western－blot法檢測(cè)膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，肺腺癌細(xì)胞中可見在130KD，190KD，110KD附近有特異性條帶，對(duì)應(yīng)位置分別為COL1A1，COL2A1，COL3A1，而在良性胸水增生上皮中表達(dá)缺失（圖7）。

圖7 肺腺癌細(xì)胞及增生上皮中Collagen protein亞型的表達(dá)

討 論

細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellurar Matrix，ECM）是由細(xì)胞所分泌的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。細(xì)胞外基質(zhì)的降解是癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。組成細(xì)胞外基質(zhì)的成分有多糖類及一些蛋白，而膠原蛋白是組成細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，目前已發(fā)現(xiàn)的形成纖維的膠原蛋白至少有27種［2，3］，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原是占比例最大的膠原類型［4］，在組織中分布廣泛，其改變與多種遺傳性膠原病、纖維化疾病、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān)。關(guān)于膠原蛋白尚無(wú)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的研究，對(duì)于其的研究多數(shù)是集中在細(xì)胞外的環(huán)境，而本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了一些肺腺癌細(xì)胞內(nèi)有膠原蛋白表達(dá)，其能夠分泌膠原蛋白。

人類的惡性腫瘤大多數(shù)是癌，而在癌癥相關(guān)的死亡病例中90%是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移引起的。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過程，一般包括惡性細(xì)胞的局部侵襲，散播，最后定植在遠(yuǎn)處地點(diǎn)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移灶的形成。多數(shù)研究證明上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial－mesenchymal transition EMT）在 腫 瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起著重要作用，且與腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥有關(guān)［5，6］。因而已成為腫瘤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。所以對(duì)于肺癌EMT現(xiàn)象的研究可能有助于進(jìn)一步尋找肺癌多元化的綜合治療模式。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種基本的生理病理現(xiàn)象，參與胚胎、組織重建和腫瘤轉(zhuǎn)移，上皮細(xì)胞表型的缺失及間質(zhì)特性的獲得是其主要特征［7］。EMT最早發(fā)現(xiàn)于發(fā)育生物學(xué)，Garry Greenburg與Elisabeth Hay經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明上皮細(xì)胞會(huì)暫時(shí)喪失他們的細(xì)胞極性，并且表現(xiàn)出具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞特征，正式提出EMT的概念［8］。以后的研究證實(shí)［9－10］，EMT在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生中起重要作用。更為值得注意的是，EMT在多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程起著重要作用，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在卵巢癌中［11］，在乳 腺 癌 中［12］，胃癌中［13］，鼻 咽癌中［14］，膀胱癌中［15］，惡性黑色素瘤中［11］等都存在著上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。由于EMT，癌細(xì)胞的活動(dòng)性更為自如并且獲得了與胚胎時(shí)期間充質(zhì)細(xì)胞相似的特征而變得更有侵襲性。在EMT過程中，上皮細(xì)胞的標(biāo)記物如E－鈣黏蛋白（E－cad）、a－連環(huán)素（a－catenin）、β－連環(huán)素（β－catenin）、γ－連環(huán)素（γ－catenin）等表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如Vimentin、纖維連接蛋白、N－鈣黏蛋白（N－cad）、a－SMA 等表達(dá)上調(diào)，以及誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist、成纖維細(xì)胞特異蛋白（FSP1）、Rho、轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（TGF－B）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等亦表達(dá)上調(diào)［6］。

這些觀點(diǎn)就為我們的假設(shè)提供了依據(jù)，EMT促進(jìn)了肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，侵襲到胸腔或者遠(yuǎn)處組織器官的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，發(fā)生了EMT的細(xì)胞在獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特性后產(chǎn)生間質(zhì)的一些成分（如膠原蛋白），且發(fā)生了膠原化。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到有纖維樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞經(jīng)證實(shí)均為肺腺癌細(xì)胞且間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Vimentin陽(yáng)性表達(dá)．這說明了這些腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生了EMT且同時(shí)膠原纖維在惡性胸腔積液的腺癌細(xì)胞中表達(dá)率為59．7%，這提示腫瘤細(xì)胞在發(fā)生了EMT的過程中產(chǎn)生了膠原纖維。而我們的Western－blot定量分析了膠原蛋白在肺腺癌細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的表達(dá)情況，顯示了膠原蛋白在轉(zhuǎn)移的腺癌細(xì)胞中具有較高的含量，在痰和肺泡灌洗液的腺癌細(xì)胞中也可以看到少量表達(dá)，這與Masson染色結(jié)果不一致，其可能是腫瘤細(xì)胞提取純度不高所致。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：COL1A1和COL3A1的表達(dá)率為22．6%，而COL2A1的表達(dá)率為5．4%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，COL1A1和COL3A1表達(dá)率要顯著高于COL2A1的表達(dá)率，并且COL1A1和COL3A1之間成正相關(guān)性。正如前文所講，器官組織發(fā)生纖維化時(shí)主要是細(xì)胞外基質(zhì)成分的異常增多，而細(xì)胞外基質(zhì)中主要是纖維性膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的異常增多［16］。

結(jié)果中Masson染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示膠原蛋白表達(dá)之間有差異性可能是因?yàn)楹笳咛禺愋愿玫脑颍琈asson染色檢測(cè)的膠原纖維是由多種類型的膠原蛋白構(gòu)成，而不單單是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，本實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞化學(xué)只檢測(cè)了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，也可能有更復(fù)雜的膠原蛋白亞型存在，因而表達(dá)率要比Masson染色的低。

本研究從不同角度檢測(cè)到了肺腺癌細(xì)胞內(nèi)有膠原蛋白，從細(xì)胞學(xué)角度提出了腫瘤細(xì)胞同樣可以同組織器官一樣發(fā)生膠原化這樣的觀點(diǎn)，但是從三種標(biāo)本膠原蛋白表達(dá)率的差異性分析，肺腺癌細(xì)胞什么時(shí)候發(fā)生膠原化及其發(fā)生機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

肺腺癌細(xì)胞發(fā)生膠原化后，化療藥物就很難進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，這樣就可以為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提出一個(gè)新的理念：努力尋找一種能夠抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的藥物，進(jìn)一步阻止細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白發(fā)生纖維化，從而為肺癌的臨床個(gè)體化用藥、耐藥的逆轉(zhuǎn)研究及肺癌的分子靶向治療等提供科學(xué)依據(jù)。

圖 版 說 明

圖1 液基細(xì)胞薄層涂片中有纖維樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞及增生上皮細(xì)胞A：胸水TCT中有纖維樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞（胞漿中）（巴氏染色 ×600）；B：痰TCT中無(wú)纖維樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞（巴氏染色 ×600）；C：BALF TCT中無(wú)纖維樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞（巴氏染色 ×600）；D：胸水TCT中無(wú)纖維樣結(jié)構(gòu)的增生細(xì)胞（巴氏染色 ×600）

圖2 透射電鏡下觀察到細(xì)胞核（黃色箭頭），纖維成聚集狀（藍(lán)色箭頭）。

圖3 腫瘤細(xì)胞沉渣切片A：腫瘤細(xì)胞胞漿圍繞胞核的纖維蔥皮樣結(jié)構(gòu)（黑色箭頭）（HE染色 ×600）；B：腫瘤細(xì)胞核已經(jīng)消失完全被纖維樣結(jié)構(gòu)取代（黑色箭頭）（HE染色 ×600）；C：腫瘤細(xì)胞內(nèi)無(wú)纖維樣結(jié)構(gòu)（HE染色 ×600）

圖4 TTF－1、CK7、Vimentin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)A：TTF－1在肺腺癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色×400）；B：CK7在肺腺癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×400）；C：Vimentin在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×400）

圖5 膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞的表達(dá)A：COL1A1在肺腺癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，以胞漿為主（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）；B：COL1A1在增生細(xì)胞中不表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）；C：COL2A1在肺腺癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，以胞漿為主（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）；D：COL2A1在增生細(xì)胞中不表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）；E：COL3A1在肺腺癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，以胞漿為主（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）；F：COL3A1在增生細(xì)胞中不表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×600）

圖6 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的Masson染色A：肺腺癌細(xì)胞的Masson染色陽(yáng)性表達(dá)，胞漿和胞膜呈亮綠色改變 ×600）；B：增生細(xì)胞的 Masson染色，不表達(dá) ×400）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Fiber－like structures in tumor cells and hyperplastic epithelial cells（TCT）A：Fiber－like structures of tumor cells in pleural fluid（cytoplasm）（Pap staining ×600）；B：No fiber－like structures of tumor cells in sputum （Pap staining ×600）；C：No fiber－like structure of tumor cells in BALF（Pap staining×600）；D：No fiber－like structure of proliferating cells in pleural fluid（Pap staining×600）

Fig．2The nucleus（yellow arrow）and fiber gathering （blue arrow）were observed by TEM

Fig．3Tumor cells sediment slices A：Fiber onion skin－like structure surrounding the nucleus in cytoplasm of tumor cells（black arrow）（HE staining×600）；B：The nucleus of tumors had disappeared completely and replaceed by fiber－like structures（black arrow）（HE staining ×600）；C：No fiber－like structures in tumor cells（HE staining×600）

Fig．4The expression of TTF－1，CK7，Vimentin in tumor cells A：TTF－1strongly expression in lung adenocarcinoma cells（Immunocytochemistry ×400）；B：CK7strongly expression in lung adenocarcinoma cells（Immunocytochemistry×400）；C：Vimentin expression in lung adenocarcinoma cells（Immunocytochemistry×400）

Fig．5The expression of Collagen isoform in lung adenocarcinoma cells A：COL1A1strongly expression in lung adenocarcinoma cells，mainly in the cytoplasm（Immunocytochemistry×600）；B：COL1A1no expression in proliferating cells （Immunocytochemistry × 600）；C：COL2A1 strongly expression in lung adenocarcinoma cells，mainly in the cytoplasm（Immunocytochemistry ×600）；D：COL2A1no expression in proliferating cells（Immunocytochemistry×600）；E：COL3A1strongly expression in lung adenocarcinoma cells，mainly in the cytoplasm（Immunocytochemistry×600）；F：COL3A1no expression in proliferating cells （Immunocytochemistry ×600）

Fig．6The Masson staining of cytology specimens A：Positive expression of lung adenocarcinoma cells ，cytoplasm and membrane was bright green ×600）；B：No expression of proliferating cells×400）

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