金 鑫 趙 艷 喻大軍 詹曉東 錢 軍＊

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科；3蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，安徽233000）

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）作為一類數(shù)量極少但具有自我更新能力的細(xì)胞，在腫瘤研究中日益受到重視。它們具有無(wú)限增生的潛能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著決定性的作用，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。人們已經(jīng)在急性髓細(xì)胞白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌等［1－3］多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞，并有分選鑒定出相關(guān)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的報(bào)道。乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）作為新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，已有在鼻咽癌、肺癌、結(jié)直腸癌［4－6］等多種腫瘤中的研究報(bào)道。但ALDH1與喉癌的相關(guān)性研究在國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化及原位雜交法對(duì)我院的喉鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤及正常組織中的ALDH1進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。

材料和方法

1．一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科2007年6月－2009年1月間喉癌患者的臨床病理資料，共計(jì)86例。隨機(jī)選取該組病例中30例切緣組織為正常對(duì)照組。蠟塊重新切片后由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立復(fù)查確認(rèn)為喉鱗狀細(xì)胞癌。所有患者術(shù)前未行放、化療。發(fā)病年齡55－82歲，中位年齡66歲；所有患者均行根治性手術(shù)，其中Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)42例，Ⅲ級(jí)29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例；聲門(mén)上型42例，聲門(mén)型33例，聲門(mén)下11例；術(shù)后隨訪期自入院確診日期開(kāi)始至2014年1月31日，失訪3例，中位隨訪期49個(gè)月。

2．試劑與方法

2．1試劑

兔抗人ALDH1多克隆抗體購(gòu)自Abcame公司、ALDH1原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司、免疫組化及原位雜交的其他試劑均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2．2方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，（1）免疫組化Elivision法檢測(cè)ALDH1蛋白的表達(dá)：標(biāo)本脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，滴加正常封閉血清，以封閉非特異性抗原。滴加ALDH1一抗（工作濃度1∶100），4℃冰箱過(guò)夜，37℃復(fù)溫45min，PBS液洗3次后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，分化、返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。（2）原位雜交檢測(cè)ALDH1mRNA的表達(dá)：標(biāo)本脫蠟、水化，暴露mRNA核酸片斷，滴加雜交液，42℃恒溫箱反應(yīng)16－20h，SSC洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，PBS洗3次，滴加生物素化過(guò)氧化物酶，37℃，20min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。所有免疫組化和原位雜交實(shí)驗(yàn)均以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，免疫組化以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

2．3ALDH1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果的判定

ALDH1蛋白位于細(xì)胞漿，以癌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)），按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；＜5%為0分，5%－25%為1分，26%－50%為2分，51%－7 5%為3分，＞75%為4分。以二者乘積分?jǐn)?shù)為最終判定結(jié)果：＜3分為陰性（－），3－5分為弱陽(yáng)性（＋），6－9分為中度陽(yáng)性（＋＋），10－12分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋），（＋）－（＋＋＋）均視為陽(yáng)性病例。最終得分＜6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

2．4ALDH1mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果的判定

以細(xì)胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)參照免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)。

2．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan－Meier法，log－rank檢驗(yàn)比較生存差異，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后因素。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．ALDH1蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

ALDH1染色定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒（圖1，2）。ALDH1在癌組織中表達(dá)高于正常組織（P＜0．05）（表1），在86例喉鱗癌組織中，ALDH1低表達(dá)61例，高表達(dá)25例；30例正常喉組織均為低表達(dá)（圖3）。32例淋巴結(jié)陽(yáng)性患者中ALDH1高表達(dá)15例，低表達(dá)17例，54例淋巴結(jié)陰性患者中，ALDH1高表達(dá)10例，低表達(dá)44例，ALDH1在淋巴結(jié)陽(yáng)性和陰性組之間表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。此外ALDH1的表達(dá)與患者年齡、有無(wú)吸煙史、喉癌的部位、浸潤(rùn)范圍、臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0．05）；與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（表2）。

2．不同組織中ALDH1mRNA的表達(dá)

喉鱗癌組織中ALDH1mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)基本一致（圖4，表1），即隨著喉癌細(xì)胞胞漿內(nèi)ALDH1mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增高，喉癌組織中ALDH1蛋白表達(dá)水平也增加。

3．ALDH1表達(dá)與喉癌患者預(yù)后關(guān)系

83例患者接受了隨訪。ALDH1蛋白高表達(dá)患者的無(wú)病生存期為（37．02±5．31）個(gè)月，5年無(wú)病生存率為32%；ALDH1蛋白低表達(dá)患者的無(wú)病生存期為（57．58±2．13）個(gè)月，5年無(wú)病生存率67%；ALDH1蛋白高表達(dá)患者的無(wú)病生存率明顯低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（圖5）。

圖1 ALDH1在高分化喉癌組織中的表達(dá)（高表達(dá)）免疫組化Elivision法 ×400圖2 ALDH1在低分化喉癌組織中的表達(dá)（高表達(dá)）免疫組化Elivision法 ×400圖3 ALDH1在對(duì)照組織中的表達(dá)（低表達(dá)）免疫組化Elivision法 ×400圖4 ALDH1mRNA在喉癌組織中的表達(dá)（高表達(dá)）原位雜交 ×400圖5 喉癌組織ALDH1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系Fig．1The expression of ALDH1in high differentiation of laryngeal cancer tissues（Elivision ×400）Fig．2The expression of ALDH1in low differentiation of laryngeal cancer tissues（Elivision×400）Fig．3The expression of ALDH1in normal tissues（Elivision×400）Fig．4ALDH1mRNA high expression in laryngeal cancer tissues（DAB ×400）Fig．5Survival curves of patients with positive and negative ALDH1expression

表1 喉癌及正常組織中ALDH1蛋白和mRNA的表達(dá)（例）Table 1 ALDH1protein and mRNA expression in different laryngeal cancer tissues

表2 ALDH1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 The relationship between ALDH1protein expression and clinicopathological characteristics

討 論

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的7．9%－35% ，其發(fā)病率目前有明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)［7］。隨著喉外科治療技術(shù)逐步成熟，喉癌的治療取得了巨大進(jìn)步，腫瘤患者的5年生存率已大大提高，但仍存在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，對(duì)放療不敏感等問(wèn)題。隨著腫瘤干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的不斷展開(kāi)，人們?cè)诙喾N腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，它作為一類數(shù)量極少但具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用。從腫瘤干細(xì)胞的角度進(jìn)行研究為臨床提高治療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)提供新的思路和切入點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞研究的首要問(wèn)題就是分離鑒定。但是由于缺乏特異的表面標(biāo)記，分離純化一直是長(zhǎng)久以來(lái)各國(guó)學(xué)者亟待解決的難題之一。目前對(duì)于干細(xì)胞的分離鑒定多集中在干細(xì)胞的分選和特異性分子標(biāo)記物的研究?jī)蓚€(gè)方面。

乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase，ALDH1）是乙醛脫氫酶家族成員之一，是催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，參與多種組織的分化與基因表達(dá)。ALDH1蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，基因位于9號(hào)染色體，有13個(gè)外顯子，由53×103個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，編碼501個(gè)氨基酸殘基［8］。自2007年，Ginestier等［9］首次報(bào)道利用ALDH1在乳腺癌實(shí)體組織中發(fā)現(xiàn)了乳腺癌干細(xì)胞后，ALDH1作為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物先后被證實(shí)為鼻咽癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌干細(xì)胞的通用標(biāo)記物［3－6，10］，同時(shí) ALDH1與患者臨床治療及預(yù)后的相關(guān)性研究亦逐步展開(kāi)，Ginestier發(fā)現(xiàn)ALDH1高表達(dá)患者的預(yù)后明顯低于ALDH1低表達(dá)患者，在頭頸部腫瘤方面Chen YC等［11］研究也發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗癌（鼻咽癌為主）的治療過(guò)程中ALDH1高表達(dá)患者顯示出明顯的治療耐受，而低表達(dá)患者在受到相同治療時(shí)，表現(xiàn)出較好的治療效果，且預(yù)后優(yōu)于ALDH1高表達(dá)患者。

本研究組在前期實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用熒光細(xì)胞化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)觀察和檢測(cè)喉癌Hep－2細(xì)胞系中的ALDH1的表達(dá)；應(yīng)用流式分選術(shù)分離ALDH1br亞群細(xì)胞，觀察ALDH1不同亞群細(xì)胞增殖能力及體外分化能力。得出在喉癌Hep－2細(xì)胞系中，ALDH1br亞群細(xì)胞具有強(qiáng)的體外分化和增殖能力，ALDH1可以作為喉癌Hep－2細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一的結(jié)論［12］。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALDH1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中有不同程度的表達(dá)，其中高表達(dá)者占29．1%（25／86），占較少部分；在淋巴結(jié)陽(yáng)性組中的ALDH1高表達(dá)率（46．9%）較淋巴結(jié)陰性組高表達(dá)率（18．5%）明顯增高；在喉鱗狀細(xì)胞癌實(shí)體腫瘤中，ALDH1有不同程度的表達(dá)，其中高表達(dá)患者比例較少，這與在細(xì)胞系中ALDH1的表達(dá)情況相似。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達(dá)與患者年齡、有無(wú)吸煙史、喉癌的部位、浸潤(rùn)范圍、臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性，與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。5年生存率分析結(jié)果亦顯示ALDH1高表達(dá)組明顯低于低表達(dá)組，提示ALDH1含量越高，其預(yù)后越差。

總之，通過(guò)檢測(cè)ALDH1在喉鱗癌組織中的表達(dá)，結(jié)合本研究組前期的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，可以認(rèn)為ALDH1能作為喉鱗癌組織腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，在喉鱗癌的預(yù)后判斷中有重要價(jià)值，且有望成為喉癌干細(xì)胞研究和靶向治療的新方向。

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