王貴年 吳 娟

乳腺癌是目前全世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性身心健康及危害其生命。近年來(lái)研究表明，miRNA 功能失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miRNA 成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1］。迄今，尚無(wú)miR -21 在乳腺癌患者血清中確切表達(dá)情況的研究報(bào)道。為此本研究擬通過(guò)檢測(cè)乳腺癌患者血清中miR-21 表達(dá)水平，重點(diǎn)探討血清miR-21與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為臨床診斷治療乳腺癌提供新的思路。

材料與方法

1.研究對(duì)象:隨機(jī)選取2012 年3 月～2013 年7 月淄博市第一醫(yī)院住院、門診乳腺疾病女性患者共49 例作為研究對(duì)象，其中乳腺良性腫瘤組23 例，患者年齡23 ～65 歲，平均年齡42.15 ±15.73 歲，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組26 例，年齡25 ～76歲，平均36. 24 ±29. 57 歲，(Ⅰ期9 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期6例)，所有研究對(duì)象均排除妊娠、感染、肝腎功能不全、糖尿病和心腦血管疾病等并發(fā)癥及無(wú)其他腫瘤等疾病。本研究中乳腺癌患者病例診斷參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第七版癌癥分期手冊(cè)(cancer staging manual)［2］，全部病例術(shù)前均未行化療或放療，內(nèi)分泌治療。采集研究對(duì)象受試者空腹靜脈血3ml，3500r/min 離心5min，取血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.儀器及試劑:ABI Prism7000 熒光定量PCR 儀(Applied bio systems 公司);總RNA 提取試劑盒(QiaGen miReasy Mini Kit)購(gòu)于德國(guó)QiaGen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(U6 snRNA，PCR primer set，has-miR-21，LNATM PCR primer set);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(Roche 公司)。

3.血清miR-21 檢測(cè):(1)miR-21 及U6 snRNA 的反轉(zhuǎn)錄:按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所有標(biāo)本操作，提取總RNA 后保存于-20℃冰箱中;按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，反轉(zhuǎn)錄前cRNA 總濃度稀釋為5ng/μl，反應(yīng)條件:42℃水浴中溫育60min，合成cDNA 溫育完成后，將此離心管置于95℃空氣浴中加熱樣品5min 取出于-20℃保存。(2)SYBR Green -real-time PCR 法測(cè)定miR -21 表達(dá):總反應(yīng)體系20μl:SYBR Green Mix 9μl，miR - 21 forward primer 2μl，miRNA reverse primer 2μl，template cDNA 2μl，RNase - free H2O 5μl;qRT -PCR 反應(yīng)條件:95℃20s 預(yù)變性;95℃10s、60℃20s，70℃10s采集熒光，40 個(gè)循環(huán)。以U6 snRNA 作為內(nèi)參，并設(shè)置空白對(duì)照，所有標(biāo)本反應(yīng)均設(shè)有3 個(gè)重復(fù)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各實(shí)驗(yàn)組血清miR -21 濃度比較用秩和檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05);血清miR -21 表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，采用Fisher 精確檢驗(yàn);以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果:陽(yáng)性曲線和研究對(duì)象血清miR-21 及U6 snRNA 的反應(yīng)曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S 型，陰性和空白對(duì)照反應(yīng)曲線呈不規(guī)則型。U6 snRNA 在所有檢測(cè)標(biāo)本中都有表達(dá)，其Ct 值在28.20 ±1.03，可作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照，說(shuō)明擴(kuò)增效果滿意，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR -21表達(dá)水平比較:以△Ct 表示標(biāo)本miR -21 的表達(dá)量，ΔCt=(CtmiR-21-CtU6snRNA)，△Ct 越低說(shuō)明miR -21表達(dá)量越高，檢測(cè)結(jié)果顯示血清miR -21 的表達(dá)量在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)量遞增，提示血清miR-21 可作為疾病進(jìn)展的指標(biāo)(表1)。

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達(dá)水平比較(△Ct，±s)

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達(dá)水平比較(△Ct，±s)

P 值為與對(duì)照組(乳腺良性腫瘤組)相比

分組 n miR-21(△Ct)P乳腺良性腫瘤組23 4.02 ±1.56Ⅰ期 9 2.11 ±1.02 0.009Ⅱ期 11 1.13 ±0.96 0.005Ⅲ期6 1.01 ±0.53 0.001

2.血清miR -21 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系:26 例乳腺癌患者進(jìn)行血清miR-21 定量檢測(cè)，基因表達(dá)變化倍數(shù)采用2-△△Ct法進(jìn)行比較，得出miR-21 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果符合正態(tài)分布(P ＞0.05)，平均值為0.60 ±0.21，以miR -21 相對(duì)表達(dá)的平均值0.60 為界，將乳腺癌患者分為miR-21低表達(dá)組和高表達(dá)組。乳腺癌組患者血清miR -21相對(duì)表達(dá)量與其年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，乳腺癌組患者血清miR -21 相對(duì)表達(dá)量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P =0.021)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(P ＜0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 血清miR-21 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

討 論

近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的病死率增長(zhǎng)了38.91%，已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病之一［3］。目前，缺少乳腺癌的理想血清分子診斷標(biāo)志物，CA153 被作為乳腺癌療效的理想觀察指標(biāo)，但不能作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物［4］。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞可用來(lái)判斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移，但早期轉(zhuǎn)移因腫瘤細(xì)胞少而隱蔽，導(dǎo)致陽(yáng)性率低，限制了其臨床應(yīng)用。隨著基因分子水平檢測(cè)方法的深入研究，乳腺癌發(fā)病機(jī)制取得了部分進(jìn)展，因此應(yīng)用qRT-PCR 法適用于檢測(cè)乳腺癌的血清分子診斷標(biāo)志物［5，6］。

miRNA 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為19 ～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)與mRNA 的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslated regions，UTRs)進(jìn)行序列特異性的結(jié)合從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。隨著對(duì)miRNA 研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA 作為一種新的基因調(diào)控機(jī)制，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化等發(fā)揮重要作用，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA 通過(guò)作用于下游基因參與了乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移侵襲及放化療抵抗等，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［7］。

研究證明，miR -21 是單個(gè)基因編碼miRNA，編碼基因位于17q23.2，miR -21 在膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，并能通過(guò)抑制PTEN、PDCD4、TIMP3、TMP -1、RECK、p53 等抑癌基因的翻譯過(guò)程參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生［8］。目前miR-21 已被證實(shí)在許多類型腫瘤中均表達(dá)異常，雖然已預(yù)測(cè)出許多miR -21 直接調(diào)控的靶基因，但僅部分臨床中得到證實(shí)。2008 年Chen 等通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA 以一種非常穩(wěn)定的形態(tài)存在于血清，血清miRNA 作為一種非損傷性檢查，在乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷方面具有良好的應(yīng)用前景。通過(guò)文獻(xiàn)分析，大量研究人員開(kāi)始關(guān)注循環(huán)miR -21，認(rèn)為血清中升高的miR -21 表達(dá)對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展、對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后等方面具有預(yù)測(cè)價(jià)值。研究者發(fā)現(xiàn)［9］，相對(duì)于健康成年女性人群，乳腺癌患者血清miR -21 顯著上升，miR -92a 顯著下降，研究成果表明，miR -21 可以作為乳腺癌診斷的血清分子標(biāo)志物。

本研究通過(guò)應(yīng)用熒光定量PCR 法對(duì)血清miR -21 表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組明顯高于乳腺良性腫瘤組，提示血清miR -21 可能會(huì)成為乳腺癌患者的診斷參考指標(biāo)，與Kumar 等［10］研究結(jié)果一致。26例乳腺癌組患者血清miR -21 的檢測(cè)結(jié)果與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性初步探討，結(jié)果顯示血清miR - 21 的表達(dá)水平與乳腺癌患者年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，乳腺癌患者血清miR -21 相對(duì)表達(dá)量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P =0.021)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(P ＜0.05)。

為了明確miR -21 與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究應(yīng)用熒光定量PCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清miR -21 高表達(dá)不僅與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且其表達(dá)上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說(shuō)明miR -21與乳腺癌的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，miR-21 可能作為一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用，以上均提示血清miR -21 有望成為未來(lái)乳腺癌診斷和治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

綜上所述，血清miR -21 在乳腺癌診治方面的臨床應(yīng)用價(jià)值存在爭(zhēng)議，因此，血清miR -21 作為乳腺癌潛在的重要分子診斷標(biāo)志物，仍需大樣本的臨床研究支持，以證實(shí)血清miR -21 表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理因素的相關(guān)性以及評(píng)價(jià)預(yù)后的臨床意義。

1 Almeida MI，Reis RM，Calin GA. MicroRNA history:discovery，recent applications，and next frontiers［J］. Mutat Res，2011，717 (1-2):1 -8

2 Edge SB，Byrd DR，Compton CC，et al. AJCC Cancer Staging Manual［M］. 7th ed. New York:Spring，2009

3 謝碧琛，李國(guó)利.Wnt/ wnt 基因信號(hào)通路與乳腺癌［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2011，27(2):125 -129

4 葉蓓，柳光宇，陸勁松，等.常用的乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物在早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值不高［J］.中國(guó)癌癥雜志，2009，19(10):807 -808

5 Van Schooneveld E，Wouters MC，Van der Auweral I，et al. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic)breast cancer and healthy volunteers ［J］. Breast Cancer Res，2012，14 (1):R34

6 Asaga S，Kuo C，Nguyen T，et al. Direct serum assay for MicroRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer［J］. Clinical Chemistry，2011，57(1):84 -91

7 Li M，Li J，Ding X，et al. MicroRNA and cancer［J］. AAPS J，2010，12(3):309 -317

8 楊旸，康春生.miRNA-21 與腫瘤相關(guān)研究新進(jìn)展［J］. 中國(guó)腫瘤臨床，2011，38(6):357 -360

9 Si H，Sun X，Chen Y，et al. Circulating microRNA -92a and microRNA -21 as novel minimally invasive biomarkers for primary breast cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(2):223 -229

10 Kumar S，Keerthana R，Pazhanimuthu A，et al. Overexpression of circulating miRNA - 21 and miRNA - 146a in plasma samples of breast cancer patients ［J］. Indian J Biochem Biophys，2013，50(3):210 -214