李 金 唐其柱 劉 源 焦 蓉

芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物，其藥理作用廣泛，不僅具有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)及抗驚厥等多種生物學(xué)效應(yīng)，還有抗炎、抗氧自由基作用［1］。由此推測，芍藥苷可能對心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有改善作用。有研究表明，LPS 侵入機體后不僅參與炎癥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生［2，3］。因此本實驗就嘗試LPS 刺激H9C2 細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，來探討芍藥苷對H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是否具有保護(hù)作用并初步探討其作用機制。

材料與方法

1.藥品及試劑:芍藥苷(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，100mg，純度＞97%)、胰蛋白酶消化液(Gibco 公司)、新生牛血清(Gibco 公司)、DMEM 培養(yǎng)基(Corning Cellgro 公司)、雙抗(Hyclone 公司)、細(xì)胞計數(shù)儀(Invitrogen 公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD FACScalibur 公司)、熒光酶標(biāo)儀(Synergy HT 公司)、DCFH-DA(碧云天生物技術(shù)研究所)。

2.H9C2 細(xì)胞的培養(yǎng):H9C2 細(xì)胞購自于中國科學(xué)院，用含10%胎牛血清，1%的青霉素(10000U/L)/鏈霉素(10000μg/ml)的DEME 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。傳3 ～5 代，待狀態(tài)穩(wěn)定后用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，傳到96 孔培養(yǎng)板上，每次傳代時細(xì)胞密度控制在1 ×105/ml，每孔100μl，進(jìn)行分組實驗。

3.細(xì)胞培養(yǎng)分組及CCK8 檢測:(1)觀察不同濃度的芍藥苷藥物刺激對胞內(nèi)ROS 含量的影響:隨機分為正常對照組和LPS 刺激組。①正常對照組:細(xì)胞饑餓18h 后僅給予無血清的培養(yǎng)基處理(下同);②LPS 刺激組:細(xì)胞加藥前饑餓18h(下同)，加入10mg/ml 的LPS，處理2h;③芍藥苷組:細(xì)胞饑餓后加入50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml 不同濃度的芍藥苷預(yù)培養(yǎng)60min，棄去培養(yǎng)基后同時加入與對照組相同濃度的LPS及相對應(yīng)濃度的芍藥苷。(2)觀察芍藥苷藥物刺激不同時間對胞內(nèi)ROS 含量的影響:隨機分為正常對照組和芍藥苷組。芍藥苷組:選取上述的一個芍藥苷濃度為100μg/ml，加入LPS及芍藥苷刺激H9C2 細(xì)胞不同的時間，加入LPS 前要芍藥苷預(yù)培養(yǎng)60min。(3)用流式細(xì)胞儀測ROS 陽性細(xì)胞數(shù):隨機分為正常對照組、LPS 刺激和芍藥苷組。1)LPS 刺激組:加入10mg/ml LPS，培養(yǎng)2h;2)芍藥苷組:加入相同濃度LPS 及100μg/ml 的芍藥苷藥物，培養(yǎng)相同的時間，加入LPS 前也是芍藥苷預(yù)培養(yǎng)60min。

4.CCK8 檢測:向96 孔板中加入100μl 的單細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h(37℃、5% CO2)后向培養(yǎng)板加入50、100、200μmol/L 不同濃度的芍藥苷藥物，在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育12h，然后向每孔加入10μl CCK8 溶液，再孵育2h，最后用酶標(biāo)儀測定在450nm 處的吸光度。

5.指標(biāo)觀測:(1)熒光酶標(biāo)儀測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平:1)按照“細(xì)胞培養(yǎng)分組及CCK8 檢測”項中(1)的分組及用實驗因素處理2h 后加入DCFH-DA 探針在37℃培養(yǎng)箱孵育30min，用溫PBS 洗3 次后用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)光波長為485nm，發(fā)射光波長為525nm，下同)檢測細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光強度，分別以每次實驗的對照組熒光強度作為100%，計算ROS 含量［4］。2)按照“細(xì)胞培養(yǎng)分組及CCK8 檢測”項中(2)的分組后，在96 孔黑板里直接加入DCFH-DA 探針，在37℃培養(yǎng)箱孵育30min，用溫PBS 洗3 次，再用上述實驗因素處理不同時間后用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光強度，分別以每次實驗的對照組熒光強度作為100%，計算ROS 含量。(2)流式細(xì)胞儀檢測ROS 陽性細(xì)胞數(shù):細(xì)胞接種于六孔板，藥物處理前，先加DCFH-DA 探針在培養(yǎng)箱孵育30min，將細(xì)胞懸于PBS 中，用細(xì)胞計數(shù)儀使細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1 ×106個，離心收集細(xì)胞，溫PBS洗3 遍。1ml PBS 重懸，上機檢測，使用488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強度(DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數(shù)設(shè)置檢測DCF)，各組細(xì)胞碎片均通過設(shè)門除去，結(jié)果用熒光細(xì)胞即ROS 陽性細(xì)胞百分率表示，重復(fù)3 次。

6.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，本組間計量資料使用One-way ANOVA 法分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.芍藥苷對H9C2 細(xì)胞活力的影響:正常對照組細(xì)胞存活率為100%，則芍藥苷在50、100、200μg/ml 濃度的細(xì)胞毒性活力分別為95. 1%、112.9%、110.2%，因此本實驗設(shè)計的芍藥苷濃度具有低細(xì)胞毒性，為了排除芍藥苷對H9C2 細(xì)胞的毒性損傷而帶來的影響細(xì)胞存活率，及干擾實驗結(jié)果，本實驗采用50、100、200μmol/L 作為本實驗的藥物濃度，詳見表1。

表1 不同濃度的芍藥苷刺激H9C2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性活力(±s，n=6)

表1 不同濃度的芍藥苷刺激H9C2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性活力(±s，n=6)

與對照組相比，* P ＜0.05

組別 劑量(μmol/ml) OD 值(450nm) 細(xì)胞存活率(%)1.14 ±0.09 100.0芍藥苷組Ⅰ 50 1.29 ±0.06* 112.9芍藥苷組Ⅱ 100 1.26 ±0.06* 110.2芍藥苷組Ⅲ對照組0 200 1.09 ±0.06 95.1

2.芍藥苷隨著藥物濃度對細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響:LPS 刺激H9C2 細(xì)胞120min 后，胞內(nèi)ROS 量明顯上升，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);加入50μg/ml 的芍藥苷后胞內(nèi)ROS 的量下降，隨著藥物濃度的增加，胞內(nèi)ROS 下降趨勢更明顯，且與LPS 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 不同濃度芍藥苷藥物刺激H9C2 細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 水平(±s，n=6)

表2 不同濃度芍藥苷藥物刺激H9C2 細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 水平(±s，n=6)

與LPS 組相比，* P ＜0.05;△濃度單位為毫克/毫升(mg/ml)

組別 劑量(μmol/ml)ROS 的含量與對照組比較(%)對照組 - 100.00 ±5.32*LPS 組 10△ 222.23 ±9.24 LPS+芍藥苷組Ⅰ 50 191.20 ±8.74*LPS+芍藥苷組Ⅱ 100 173.19 ±2.97*LPS+芍藥苷組Ⅲ 200 145.40 ±9.89*

3. 芍藥苷隨著時間對胞內(nèi)ROS 水平的影響:加入LPS 30min 后胞內(nèi)ROS 含量開始上升，刺激120min 后胞內(nèi)ROS 含量上升更明顯，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);加入芍藥苷藥物刺激后，胞內(nèi)ROS 都有不同程度的降低，當(dāng)刺激足夠的時間胞內(nèi)ROS 下降明顯低于LPS 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表3。

表3 LPS 與芍藥苷藥物刺激H9C2 細(xì)胞不同時間胞內(nèi)ROS 水平(±s，n=6)

表3 LPS 與芍藥苷藥物刺激H9C2 細(xì)胞不同時間胞內(nèi)ROS 水平(±s，n=6)

LPS 組與對照組相比，* P ＜0.05;LPS + 芍藥苷組與LPS 組相比，#P ＜0.05

組別 時間(min) ROS 的含量與對照組比較(%)30 100.00 ±5.25 LPS 組Ⅰ 30 224.35 ±6.35*LPS+芍藥苷組Ⅰ 30 208.00 ±8.25 LPS 組Ⅱ 60 245.72 ±7.42*LPS+芍藥苷組Ⅱ 60 211.14 ±9.88#LPS 組Ⅲ 120 272.94 ±11.41*LPS+芍藥苷組Ⅲ 120 161.28 ± 9.58對照組#

4. 流式細(xì)胞儀測定胞內(nèi)ROS 水平:LPS 刺激H9C2 細(xì)胞2h 后，與對照組相比ROS 陽性細(xì)胞百分率明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);加入LPS 與芍藥苷藥物刺激相同的時間后，ROS 陽性細(xì)胞百分率與LPS 組相比明顯下降，且(P ＜0.05)。

表4 不同處理因素刺激H9C2 細(xì)胞2h 對ROS 產(chǎn)生的影響(±s，n=3)

表4 不同處理因素刺激H9C2 細(xì)胞2h 對ROS 產(chǎn)生的影響(±s，n=3)

與對照組相比，* P ＜0.05;LPS +芍藥苷組與LPS 組相比，#P ＜0.05

組別 ROS 陽性細(xì)胞百分率(%)1.98 ±2.14 LPS 組 3.30 ±1.81*LPS+芍藥苷組 2.36 ±3.06*#對照組

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激H9C2 細(xì)胞30min 胞內(nèi)ROS 水平開始上升，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，隨著刺激時間的增加，胞內(nèi)ROS 上升趨勢更明顯，且細(xì)胞培養(yǎng)時在光鏡下也可觀察到大量的細(xì)胞碎片、皺縮細(xì)胞，這都表明10mg/ml 的LPS 可以誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，用LPS 與不同濃度的芍藥苷藥物刺激H9C2 細(xì)胞后，胞內(nèi)ROS 含量明顯低于LPS組(P ＜0.05)，且下降趨勢呈現(xiàn)濃度依賴性。LPS 與芍藥苷藥物共同刺激H9C2 細(xì)胞不同時間，胞內(nèi)ROS含量明顯低于相應(yīng)的LPS 組(P ＜0.05)，且下降趨勢呈現(xiàn)時間依賴性。芍藥苷能夠降低胞內(nèi)超負(fù)荷ROS的含量，這提示芍藥苷藥物能夠改善H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。分析結(jié)果，我們推測芍藥苷藥物可能通過以下作用機制來改善氧化應(yīng)激損傷:①抑制胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生及增加清除氧自由基的活性酶，當(dāng)芍藥苷藥物達(dá)到適當(dāng)?shù)臐舛燃皶r間干預(yù)，可抑制胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生及增加清除氧自由基的活性酶，最終使胞內(nèi)超負(fù)荷的ROS 明顯下降［5］;②穩(wěn)定細(xì)胞膜通透性，平衡離子通道使細(xì)胞高分子物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等免受氧自由基的破壞，減輕細(xì)胞的損傷與死亡［6］;③抑制炎癥的發(fā)生，通過抑制LPS 的刺激而阻斷因炎癥誘發(fā)更多的氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)［7］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實芍藥苷具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［8］。本實驗證實芍藥苷對H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有改善作用。近年來氧化應(yīng)激與心肌肥厚的關(guān)系受到了國內(nèi)外越來越多學(xué)者的關(guān)注，大量文獻(xiàn)也證實了氧化應(yīng)激與心肌肥厚的形成密切相關(guān)［9］。本實驗為我們應(yīng)用芍藥苷改善心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而有效抑制心肌肥厚提供了理論依據(jù)，但本實驗只是檢測了活性氧指標(biāo)，而未檢測心肌肥厚相關(guān)的指標(biāo)，且未涉及動物在體實驗的部分，因此存在一定的局限性。

綜上所述，本研究通過LPS 誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷觀察到芍藥苷對H9C2 細(xì)胞低毒性，可降低胞內(nèi)ROS 的水平，具有改善H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。希望以后可以進(jìn)一步深入研究其作用機制及作用途徑，為芍藥苷防治心肌肥厚展示更廣闊的前景。

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