王 勤 敖華飛 顧 健 李 聰

梅尼埃病是臨床上較為常見的一種的內(nèi)耳疾病，主要病理改變?yōu)槟っ月贩e水，但其病因至今仍未完全明確。而自身免疫性梅尼埃病屬于自身免疫性內(nèi)耳病的一種，臨床上其有效、合理的治療方案就包括激素的應(yīng)用，而激素全身應(yīng)用的不良反應(yīng)較大，限制了其使用人群。泊洛沙姆407 是研究、應(yīng)用最為廣泛的一種熱敏型凝膠，且具有低溫時為液體，溫度升高時轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的反向熱敏凝膠特性。這樣可以以液體形式給藥，藥液在中耳內(nèi)立刻轉(zhuǎn)變成凝膠，能夠達(dá)到延長藥物在中耳內(nèi)的滯留時間，提高藥物生物利用度的效果。故筆者將泊洛沙姆407 作為載體將地塞米松應(yīng)用于鼓室局部，觀察其治療效果，以期使之成為治療的理想制劑。

材料與方法

1.材料:(1)實(shí)驗(yàn)動物:清潔級SD 雄性大鼠40 只，體重220 ～250g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司［SCXK(滬)2008 -0016］，實(shí)驗(yàn)動物合格證號:2008001628690，無噪聲暴露和藥物使用史，耳廓反射靈敏，電子耳鏡檢查外耳道、鼓膜均無異常，術(shù)前均進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)(ABR)，結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。(2)試劑:地塞米松(上海楷洋生物有限公司)，泊洛沙姆407(poloxamer407，德國BASF 公司)，地塞米松對照品(中國藥品生物制品檢定所);其他試劑均為分析純。(3)儀器設(shè)備:十萬分之一電子天平(AE240 型，梅特勒-托利多有限公司)，DK -8D 型電熱恒溫槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，88 -I 型定時恒溫磁力攪拌器(上海思樂儀器有限公司)，UV -9200 型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，TK-20A 型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易公司)。

2.地塞米松熱敏性凝膠的制備:參照本實(shí)驗(yàn)組已報(bào)道的耳用地塞米松熱敏性凝膠的制備及性能的檢測。用等滲PBS溶液配成濃度為17%的泊洛沙姆407 溶液，然后加入一定量的地塞米松(濃度為10mg/ml)，磁力攪拌器攪拌均勻，置于4℃左右冰箱冷藏溶脹48h，使凝膠充分溶解膨脹，分散均勻，得到澄清透明溶液。

3.自身免疫性梅尼埃病模型的建立及評估:(1)抗原制備:制備同種粗制內(nèi)耳抗原(isologous crude inner ear antigens，ICIEAg)，具體方法如下:清醒狀態(tài)下斷頭，取聽泡，分離膜迷路，置于PBS 中，經(jīng)研磨、粉碎及均漿，離心直徑15cm，1500r/min 離心10min，取上清測定蛋白質(zhì)含量，分裝后低溫干燥，制成凍干粉備用。(2)全身免疫:實(shí)驗(yàn)組按常規(guī)免疫方法，每次分別注射于SD 大鼠右后足和背部及腹部多點(diǎn)皮下。首次采用ICIEAg 0.4mg 加弗氏佐劑免疫0.2ml，再分別采用ICIEAg 0.2mg 加弗氏佐劑0.2ml 全身強(qiáng)化免疫2 次，每次免疫中間間隔10 天。末次免疫后10 天，用ICIEAg 0.05mg 加弗氏佐劑0.025ml 行淋巴囊局部免疫。對照組SD 大鼠采用PBS 代替ICIEAg，余步驟同上。(3)觀察指標(biāo):在免疫前和內(nèi)淋巴囊局部免疫后2 周檢測ABR。動物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(80mg/kg)麻醉，在聲電屏蔽室內(nèi)接受功能檢測，測試中由恒溫加熱墊維持體溫。刺激信號的產(chǎn)生和誘導(dǎo)電位記錄均由美國TDT(System3)聽覺誘發(fā)電位工作站完成。刺激聲采用短純音，刺激頻率為21.37 次/秒，范圍為(8 ～32)kHz，采集放大倍數(shù)為100k，采集寬度為(0.3 ～3.0)kHz，疊加次數(shù)為500 次，測試從90dB SPL 開始，以Ⅲ波存在的最低聲強(qiáng)為反應(yīng)閾值。

4.分組與干預(yù):將造模成功的實(shí)驗(yàn)組SD 大鼠按照隨機(jī)原則分成3 組:A 組:生理鹽水組;B 組:含地塞米松10mg/ml 的地塞米松溶液組;C 組:地塞米松熱敏性凝膠組。用藥方式為顯微鏡下經(jīng)鼓膜1 次性直接注射0.1ml 至鼓室內(nèi)。各組SD 大鼠分別在用藥當(dāng)天及用藥后7、14、21 天分別測定其ABR 閾值。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并進(jìn)行t 檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.地塞米松熱敏性凝膠的特性:本實(shí)驗(yàn)組制備的凝膠在常溫下成液體狀態(tài)，在接近人體中耳內(nèi)溫度34℃時形成凝膠。

2.動物模型構(gòu)建結(jié)果:免疫前后ABR 閾值比較，SD 大鼠雙耳均有提高，免疫前后各個頻率比較P 均＜0.05，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 免疫前后ABR 閾值(dB SPL)

3.藥物治療效果:用藥后第7、14 天B、C 組大鼠與A 組比較均出現(xiàn)各頻率ABR 閾值降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，說明經(jīng)地塞米松局部治療后聽力均有恢復(fù)，即，地塞米松對自身免疫性梅尼埃病具有一定的治療作用。用藥后第7 天B、C 組之間進(jìn)行比較可得頻率在4kHz、8kHz 時，C 組比B 組ABR 閾值有所降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.074);而頻率在16kHz 時，B、C 組之間比較，ABR 閾值差異較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。用藥后第14天B、C 組各頻率均存在明顯差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。說明自制的地塞米松熱敏性凝膠在治療自身免疫性梅尼埃病比常規(guī)的地塞米松溶液具有較明顯的療效(表2、表3)。

表2 用藥后7 天各組ABR 閾值(dB SPL)

表3 用藥后14 天各組ABR 閾值(dB SPL)

討 論

中內(nèi)耳疾病是損害人民身體健康和降低生活質(zhì)量的多發(fā)病之一，發(fā)生率高，英國約0.9%，我國也是中內(nèi)耳疾病的高發(fā)區(qū)，發(fā)生率為0.5% ～4.3%。中內(nèi)耳疾病患者治療需大量糖皮質(zhì)激素，但血-外淋巴屏障嚴(yán)重限制藥物到達(dá)中內(nèi)耳組織，為達(dá)到有效藥物濃度，需要使用較大劑量。然而全身應(yīng)用激素不良反應(yīng)較大，更為高血壓、糖尿病、胃潰瘍等患者的禁忌，傳統(tǒng)局部應(yīng)用也存在不同的弊端，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。所以，近年來鼓室內(nèi)局部用藥治療中、內(nèi)耳疾病成為國內(nèi)外學(xué)者探討的熱點(diǎn)，如何在局部保持藥物的高濃度長期給藥成了研究的關(guān)鍵，在以往的研究中，主要采用如下方式給藥:鼓室內(nèi)直接注射、藥物注射至蝸窗龕處的預(yù)置材料、半種植式微導(dǎo)管持續(xù)給藥裝置等，這些方式均存在各自的不足之處。筆者認(rèn)為理想中的制劑應(yīng)當(dāng)滿足3 個條件:①較好的緩釋性，能長期釋藥;②局部藥物濃度恒定，作用時間長，在鼓室內(nèi)能夠長時間滯留;③用藥方式簡便，減少患者的痛苦。

近年來，由于材料科學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)大量的藥物緩釋材料，為中內(nèi)耳疾病的局部治療提供幫助，熱敏性凝膠是一種環(huán)境敏感型凝膠，其在室溫下為溶液狀態(tài)，在體溫下能夠發(fā)生相轉(zhuǎn)化，形成非化學(xué)交聯(lián)型半固體凝膠，目前，常見的熱敏凝膠為泊洛沙姆407［1～3］。泊洛沙姆407 是70%乙烯氧化物(POE)秘30%丙烯氧物(POP)組成，具有低溫時為液體，隨著度的升高則變成凝膠的性質(zhì)，由于這種特性，常常制成不同給藥途徑，加載不同類型藥物的控釋凝膠給藥系統(tǒng)［4～7］。泊洛沙姆407 經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)，由于其很好的生物相容性，很快便被使用于臨床治療研究的各個領(lǐng)域。Gupta 等［8］將毛喉素?zé)崦裟z用于青光眼治療，取得較好的效果。Mansoor 等［9］制成了用于腫瘤治療的紫杉醇泊洛沙姆407 原位凝膠注射液，結(jié)果腫瘤的生長速率，動物死亡率大大降低。OH 等［10］制備了以泊洛沙姆407 為外殼的納米粒，效果良好。此外泊洛沙姆也被用于口腔黏附給藥系統(tǒng)的生物黏附性［11］。故筆者結(jié)合當(dāng)前藥劑學(xué)研究進(jìn)展，就將泊洛沙姆407 作為地塞米松的緩釋載體制成地塞米松熱敏性凝膠。

前期筆者已采用立式Franz 擴(kuò)散池來檢測過該凝膠藥物的體外釋放過程，結(jié)果表明，制備的地塞米松耳用熱敏型凝膠累計(jì)釋放百分率接近90%時需要10 天時間，整個藥物釋放過程完全，且具有一定的控釋作用，符合理性制劑的條件。經(jīng)過這次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明，隨著藥物作用時間的延長，地塞米松凝膠組的療效明顯優(yōu)于地塞米松溶液組。體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是吻合的，配置的地塞米松熱敏性凝膠最突出的特點(diǎn)就是黏附力很強(qiáng)，藥物表面活性高，增加藥物與局部的接觸時間和面積，同時減少了用藥次數(shù)，增加了藥物療效，降低了對局部的刺激。

本實(shí)驗(yàn)在已經(jīng)全身致敏的大鼠中采用局部ICIEAg 局部免疫后，大鼠出現(xiàn)明顯的聽力損失，成功制備的大鼠自身免疫性梅尼埃病的動物模型。再次基礎(chǔ)上將照模成功的動物模型進(jìn)行隨機(jī)分組干預(yù)，經(jīng)過觀察用藥后第7、14 天的ABR 閾值的觀察，B 組與A 組相比各頻率之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，地塞米松局部治療對自身免疫性梅尼埃病有一定的療效。而B 組與C 組之間進(jìn)行比較，在用藥后第7 天時，頻率在16kHz 開始出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，而此時4kHz、8kHz 雖有不同，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。到用藥后第14 天時，各頻率(4kHz、8kHz、16kHz)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，即說明地塞米松熱敏性凝膠局部治療對自身免疫性梅尼埃病具有一定的療效，而且較地塞米松水溶液具有更好的療效。這種優(yōu)越性應(yīng)該就是劑型的改變產(chǎn)生的，將泊洛沙姆407 作為載體的地塞米松熱敏性凝膠在鼓室內(nèi)可以緩慢釋放，長期緩慢作用于病灶局部，可以產(chǎn)生持久的療效，所以療效優(yōu)于地塞米松水溶液。

將泊洛沙姆407 作為地塞米松的緩釋載體制成地塞米松熱敏性凝膠，結(jié)合了泊洛沙姆407 的良好的載體緩釋作用和地塞米松治療梅尼埃病的作用，使地塞米松局部作用的藥效進(jìn)一步提高，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

1 Cho HJ，Balakrishnan P，Park EK，et al. Poloxamer/cyclodextrin/chitosan-based thermoreversible gel for intranasal delivery of fexofenadine hydrochloride［J］. J Pharm Sci，2010，100(2):681 -691

2 Dumortier G，Grossiord JL，Agnely F，et al. A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics［J］. Pharm Res，2006，23(12):2709 -2728

3 Monti D，Burgalassi S，Rossato MS，et al. Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug deliverry. PartⅡ:In vitro/in vivo evaluation［J］. Int J Pharm，2010，400(1 -2):32 -36

4 Niu G，Du F，Song L，et al. Synthesis and characterization of reactive poloxamer 407s for biomedical applications［J］. J Control Release，2009，138(1):49 -56

5 Yong CS，Choi JS，Quan QZ，et al. Effect of sodium chloride on the gelationtemperature，gel strength and bioadhesive force of poloxamer gels containing diclofenac sodium［J］. Int J Pharm，2001，226(1 -2):195 -205

6 Albertini B，Passerini N，Di Sabatino M，et al. Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug delivery. Part I:Formulation，manufacturing and characterization［J］.Int J Pharm，2010，399(1-2):71-79

7 Monti D，Burgalassi S，Rossato MS，et al. Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug delivery. PartⅡ:in vitro/in vivo evaluation［J］. Int J Pharm，2010，400(1 -2):32 -36

8 Gupta S，Samanta MK，Raichur AM. Dual - drug delivery system based on In situ gel-forming nanosuspension of forskolin to enhance efficacy［J］. AAPS PharmSci Tech，2010，11(1):322 -335

9 Amili MM，Lai PK，Shenov DB，et al. Intratumoral administration of paclitaxel in an in situ gelling poloxamer 407 formulation［J］. Pharm Dev Technol，2002，7(2):195 -202

10 Oh KS，Lee KE，Han SS，et al. Formation of core/shell nanoparticles with a lipid core and their application as adrug delivery system［J］.Biomacromolecules，2005，6(2):1062 -1067

11 Cafaggi S，Leardi R，Parodi B，et al. Preparation and evaluation of a chitosan salt - poloxamer 407 based matrix for buccal drug delivery［J］. J Control Release，2005，102(1):159 -169