郝蘭香，潘 超*，蔡建春

(廈門大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 1.病理科； 2.胃腸外科， 福建 廈門 361004)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位a(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha，PIK3CA)是目前3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)家族成員中發(fā)現(xiàn)的唯一可以發(fā)生體細(xì)胞突變而致癌的基因，約30%的人類實(shí)體瘤存在PIK3CA基因的突變[1]。胃癌作為中國(guó)最常見的惡性實(shí)體瘤之一，其發(fā)病率及病死率較高，其中基因突變?cè)谖赴┑陌l(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。鑒于相當(dāng)一部分單核苷酸多態(tài)性的頻率在不同民族、人群有顯著差異，中國(guó)人群胃癌組織中是否存在PIK3CA基因突變？其突變頻率與突變模式如何？目前國(guó)內(nèi)未見大規(guī)模病例研究。本研究旨在檢測(cè)中國(guó)人群胃癌組織中PIK3CA基因突變情況，探討其突變與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為胃癌的臨床治療、預(yù)后判斷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院2007至2010年間行胃癌根治手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的標(biāo)本400例，患者均為中國(guó)人，年齡20～80歲。所獲標(biāo)本均征得患者知情同意。

1.2 主要試劑

石蠟組織DNA提取試劑盒(北京信然達(dá)科技有限公司)；人類PIK3CA基因突變檢測(cè)試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥公司)。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA抽提：對(duì)入選病例石蠟包埋組織樣本行5 μm厚切片，每例10片，切片置于4 ℃冰箱保存。按照石蠟組織DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。

1.3.2 熒光PCR法檢測(cè)胃癌PIK3CA基因突變：人類PIK3CA基因突變檢測(cè)試劑盒基于實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)結(jié)合了特異引物和雙環(huán)探針兩種技術(shù)，檢測(cè)DNA樣品中含有的突變基因。利用特異引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴(kuò)增放大。與此同時(shí)，利用雙環(huán)探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合特別的PCR反應(yīng)程序和高特異Taq酶的使用，在實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品DNA中突變的檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)稀有突變檢測(cè)的高特異性和高靈敏度，即高的選擇能力。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

突變結(jié)果確定：首先確定樣品各個(gè)反應(yīng)管各自的突變Ct值，然后確定該樣品的外控Ct值，根據(jù)不同的突變Ct值，把樣品檢測(cè)結(jié)果分為陰性、弱陽性及強(qiáng)陽性(表1)。

當(dāng)樣品突變Ct值大于或等于陰性臨界值時(shí)，則該樣品為陰性。當(dāng)樣品突變Ct值小于陰性臨界值時(shí)，進(jìn)行下列判斷：

1)當(dāng)某個(gè)反應(yīng)管的突變Ct值小于陽性臨界值時(shí)，則該樣品為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的突變陽性，即強(qiáng)陽。

2)當(dāng)反應(yīng)管的突變Ct值大于或等于陽性臨界值時(shí)，則計(jì)算該反應(yīng)管的ΔCt Cut-off值。若反應(yīng)管的ΔCt值小于相對(duì)應(yīng)的ΔCt Cut-off值，則該樣品也為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的突變陽性，即弱陽。反之，則為陰性。

1.3.3 基因突變類型分析：將篩查出的陽性病例PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析PIK3CA基因突變與胃癌臨床病理特征如腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)、患者年齡、預(yù)后(3年中位生存期)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌PIK3CA基因突變檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 胃癌PIK3CA基因突變陽性病例篩選結(jié)果(熒光PCR)：400例胃癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有30例發(fā)生了PIK3CA基因突變，突變率為7.5%，而作為對(duì)照的400例癌旁組織無1例發(fā)生基因突變，突變率為0。陽性病例熒光PCR結(jié)果截圖如下(圖1)。

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果判定Table 1 Determination of sample test results

A.H1047R positive; B.E545K positive; C.H1047L positive; D.E542K positive 圖1 胃癌PIK3CA檢測(cè)陽性截圖(熒光PCR) Fig 1 PIK3CA mutation(fluorescence PCR)

2.1.2 胃癌PIK3CA基因突變陽性病例測(cè)序結(jié)果(圖2)和PIK3CA基因突變類型(表2)：30例陽性病例其突變位點(diǎn)主要集中在第9外顯子(E542K，10例，占33%；E545K，6例，占20%)和第20外顯子(H1047R，11例，占37%；H1047L，3例，占10%)，未檢測(cè)到第9外顯子E545D位點(diǎn)突變，此點(diǎn)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道不同。

表2 中國(guó)人胃癌PIK3CA基因突變類型

2.2 PIK3CA基因突變與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

PIK3CA基因突變?cè)谀[瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)及患者年齡等組間比較無明顯差異，而在預(yù)后組間有顯著性差異(P<0.05)(表3)。

表3 PIK3CA基因突變與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

*P<0.05 compared with survival period ≤3 years.

A.H1047R; B.E545K; C.H1047L; D.E542K圖2 胃癌中PIK3CA基因突變的測(cè)序結(jié)果Fig 2 PIK3CA mutation in gastric cancer

3 討論

PI3K是脂質(zhì)激酶，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路(PI3K/AKT信號(hào)通路)控制著眾多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。PIK3CA是Ⅰ型PI3K的P110催化亞單位，即PI3K p110a的編碼基因，定位于染色體3q26.3，長(zhǎng)34kb，含20個(gè)外顯子，是目前PI3K家族成員中發(fā)現(xiàn)的唯一可發(fā)生體細(xì)胞突變而致癌的基因。PIK3CA基因突變可導(dǎo)致PI3K p110a過度表達(dá)，引發(fā)PI3K/AKT信號(hào)通路持續(xù)活化，進(jìn)而加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)化療拮抗，以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[1]。

文獻(xiàn)報(bào)道PIK3CA在包括結(jié)腸癌[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4]等多種實(shí)體瘤中呈高頻突變,除少數(shù)突變發(fā)生在第l外顯子(P85a)外[5]，80%PIK3CA基因突變都集中在第9(螺旋區(qū)，包括E542K、E545K、E545D等突變類型)和第20(激酶區(qū)，包括H1047R，H1047L等突變類型)外顯子的特異性位點(diǎn)上[6]。它的這種非隨機(jī)高頻突變也顯示了其在腫瘤發(fā)生中的意義。

胃癌作為一種基因病，與多種癌基因的激活有關(guān)，在與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的眾多癌基因中，PIK3CA突變頻率較高，其突變率可達(dá)14.3%[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中國(guó)人群胃癌組織中也存在PIK3CA基因突變，但其突變頻率(7.5%)和熱點(diǎn)突變模式(主要位于E542K和H1047R位點(diǎn)，小部分在E545K和H1047L位點(diǎn)，無E545D位點(diǎn)突變)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道存在差異，這可能與一些影響因素有關(guān)，如種族和地理差異、樣本來源、儲(chǔ)存與分離DNA的方法等。胃癌組織中PIK3CA基因突變明顯影響著腫瘤的預(yù)后及治療。PIK3CA基因突變患者較未發(fā)生PIK3CA基因突變患者之間，生存期存在顯著差異，預(yù)后相對(duì)較差。提示，PIK3CA基因突變對(duì)胃癌預(yù)后判斷具臨床意義。此外，研究表明[8- 9]，靶向藥物赫賽汀應(yīng)用于HER- 2陽性胃癌患者，可明顯提高患者的生存期，但存在PIK3CA基因突變患者卻療效不佳，究其原因是PIK3CA基因突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥。顯示，PIK3CA基因突變對(duì)于靶向藥物療效預(yù)測(cè)具有重要意義。PIK3CA基因突變引發(fā)PI3K/AKT信號(hào)通路持續(xù)活化，通過多個(gè)環(huán)節(jié)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，PIK3CA成為腫瘤調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，將PIK3CA作為腫瘤治療的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)具潛在臨床價(jià)值。

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