陶冬英， 王 云，倪晶晶，楊菊林，范任華

(1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 人體形態(tài)教研室， 浙江 寧波 315104； 2.寧波市第二醫(yī)院 外科， 浙江 寧波 315100；3.長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

肝纖維化是各種肝細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)肝臟慢性損傷所引起的肝臟病理改變，日前研究認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellaate cell，HSC)激活是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[1]。 脂聯(lián)素(adiponectin)是一種脂肪組織特異性分泌的蛋白質(zhì)，它具有促進(jìn)血漿游離脂肪酸氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)功能[2]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素具有一定的抗肝纖維化作用，但脂聯(lián)素抗纖維化機(jī)制還未完全闡明，本研究擬構(gòu)建人全長(zhǎng)脂聯(lián)素真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞檢測(cè)其表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素在肝纖維化中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

L02細(xì)胞(東南大學(xué)病理教研室饋贈(zèng))，pEGFP-C1(Clontech公司)，Trizol reagent、Adiponectin、MMP- 9、內(nèi)參β-Actin 引物、RT-PCR試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ(Takara公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，明膠(Sigma公司)，復(fù)性液、孵育液均購(gòu)自Bio-Rad公司，Anti-Adiponectin鼠抗人抗體(Abcam公司)，HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組載體和轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞：以人脂肪細(xì)胞總mRNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增adiponectin基因外顯子全長(zhǎng)DNA片段,引物見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化基因adiponectin，酶消化的PCR產(chǎn)物插入pEGFP-C1獲得重組綠色熒光蛋白載體adi-pEGFP-C1質(zhì)粒。重組載體經(jīng)酶消化鑒定和基因測(cè)序驗(yàn)證重組載體構(gòu)建成功。重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JMl09中擴(kuò)增，裂解細(xì)菌抽提純化重組載體質(zhì)粒。然后，重組質(zhì)粒用脂質(zhì)Lipofectamine2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞, 熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光分布均勻的細(xì)胞，數(shù)500個(gè)細(xì)胞得出其中有熒光的細(xì)胞155個(gè)，轉(zhuǎn)染效率為31%， 用300 μg/mL的G418的篩選，獲得穩(wěn)定的adi-pEGFP-C1/L02細(xì)胞系。細(xì)胞分組：未轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞組(a組)、轉(zhuǎn)染空載體的肝細(xì)胞組(b組)、轉(zhuǎn)染重組脂聯(lián)素載體肝細(xì)胞組(c組)，用MTT法檢測(cè)各組的生存率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)(圖1)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)MMP- 9 mRNA表達(dá)：用Trizol reagent 提取上述各組L02總RNA，取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系如下：無(wú)RNAse H2O 7.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL,10×緩沖液 2 μL,dNTP 2UL, 寡核苷酸 dT 1 μL，AMV 1 μL, RNAse 抑制劑 0.5 μL,RNA 1 μg，補(bǔ)水至20 μL，42 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃ 5 min；取4 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，依次加入5×緩沖液2.0 μL，上下游引物各2.8 μL，5 U/μL TqE 0.25 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL,dNTP 0.4 μL，加入滅菌的雙蒸水至反應(yīng)總體積20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件(表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，復(fù)日Smart生物電泳圖像分析儀掃描，進(jìn)行吸光度分析，半定量比較，以每個(gè)標(biāo)本的目的條帶與該標(biāo)本β-actin條帶吸光度的比值，作為該標(biāo)本目的基因的相對(duì)表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)(圖2)。

表1 引物及產(chǎn)物條件Table 1 Primers and product conditions

A.L02 cell; B.L02/pEGFP-C1; C.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with A and B圖1 MTT檢測(cè)重組載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生存率Fig 1 The survival rate of liver cells transfected with the recombinant vectors was detected by MTT assay

A. 1:L02 cell, 2:L02/pEGFP-C1, 3:L02/adi-pEGFP-C1; B.1:L02 cell, 2:L02/pEGFP-C1, 3:L02/adi-pEGFP-C1; *P<0.01 compared with A and B圖2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)MMP- 9 mRNA表達(dá)水平Fig 2 The expression levels of MMP- 9 mRNA was detected by Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)

1.2.3 明膠酶譜法檢測(cè)MMP- 9活性：用明膠酶譜法檢測(cè)各分組MMP- 9的活性。用含1 mg/mL明膠的8% SDS-PAGE澆制電泳板。等量的條件培養(yǎng)基加等量的加樣緩沖液混合，上樣。電壓80～150 V，電泳5～6 h，取出凝膠，用1×酶譜復(fù)性緩沖液(1×zymogram renaturation buffer)漂洗2×15 min, 1×酶譜孵育緩沖液(1×Zymogram development buffer)孵育過(guò)夜，以上加樣緩沖液、復(fù)性液和孵育液，考馬斯亮藍(lán)G- 250染色2 h，脫色至藍(lán)色背景有透明條帶出現(xiàn)為止。MMP- 9降解的明膠條帶吸光度用Scio Image軟件掃描，MMP- 9活性大小用A值:條帶面積×吸光度(absorbance×area)表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)(圖3)。

A:1.L02 cell, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1; B.1.L02 cell, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with A and B圖3 凝膠酶譜檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染adi-pEGFP-C1/L02的 培養(yǎng)上清液中MMP- 9活性Fig 3 The activity of MMP- 9 in culture supernatant of L02 cells transfected with adi-pEGFP-C1 was analyzed by Gel zymography

1.2.4 Western blot檢測(cè)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)：待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，胰蛋白酶消化收集各分組的細(xì)胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，將蛋白樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS.PAGE)后，用濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移到NC膜上，膜以封閉液(50 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L 氯化鈣 0.01%消泡劑(Antifoam A), 0.05%吐溫- 20(Tween- 20), 5%疊氮鈉(NaN3),脫脂奶粉，室溫振蕩封閉2 h，加入以封閉液稀釋的一抗(1∶400)4 ℃冰箱過(guò)夜，TPBS洗滌10 min,1∶5 000稀釋的二抗于室溫孵育2 h，TPBS洗滌10 min，加發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，顯影的目的及內(nèi)參條帶吸光度用Scio Image軟件掃描，用A值:條帶面積×吸光度(absorbance×area)表示相對(duì)表達(dá)量的大小，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)(圖4)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

A:pEGFP-C1/L02 cells(left) and adi-pEGFP-C1/L02 cells(right)(×200); B:the protein and β-actin in L02 cells were detected using Western blot analysis, 1.L02 cells, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1; C:the relative levels of adiponetin protein in L02 cells were exhibited, 1.L02 cells, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with 1 and 2

圖4Westernblot檢測(cè)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)
Fig4TheexpressionofadiponectininL02cellstransfectedwithadi-pEGFP-C1wasanalyzedbyWesternblotanalysis

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)重組載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生存率

未轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞存活率比轉(zhuǎn)染空載體及重組載體肝細(xì)胞高(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染空載體及重組載體肝細(xì)胞存活率無(wú)差異。

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT- PCR)

檢測(cè)MMP- 9mRNA表達(dá)水平，整合adi-pEGFP-C1/L02細(xì)胞的MMP- 9 mRNA與空白對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。

2.3 凝膠酶譜結(jié)果

顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染adi-pEGFP-C1/L02的培養(yǎng)上清液中MMP- 9活性上調(diào)(P<0.05)。

2.4 成功構(gòu)建adi-pEGFP-C1綠色熒光載體

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人肝細(xì)胞系L02細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞顯示adiponectin表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)[2],具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心血管系統(tǒng)、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及抗炎等多種功能[3- 5]。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與肝纖維化密切相關(guān)。研究報(bào)道肝臟受損時(shí)，分泌大量的TGF-β1、TNF-α、PDGF、CTGF和IL- 6等因子，刺激間質(zhì)HSC增殖、活化，并促使活化的HSC遷移、聚集于炎性反應(yīng)受損區(qū)，合成大量ECM沉積于肝細(xì)胞間質(zhì)，進(jìn)而發(fā)生肝纖維化[6]。在大鼠HSC培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，靜息的HSC可以表達(dá)合成脂聯(lián)素，脂聯(lián)素可以減少α-SMA和PCNA的表達(dá)而抑制活化的HSC增殖及遷移，并促進(jìn)活化的HSC凋亡以抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。有研究報(bào)道非酒精性肝病患者血漿中脂聯(lián)素水平隨著肝臟炎癥及纖維化的加重明顯下降，提示脂聯(lián)素與肝纖維化進(jìn)程存在某種關(guān)聯(lián)。有研究顯示CCl4復(fù)制早期肝損害小鼠模型RT-PCR檢測(cè)脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，并表明脂聯(lián)素可能作為一種抗炎蛋白參與早期肝細(xì)胞與組織損傷的修復(fù)。

基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(MMP- 9)在肝纖維化疾病中亦扮演重要角色。有研究報(bào)道CCl4大鼠肝纖維化動(dòng)物模型中MMP- 9在肝纖維化早期表達(dá)上調(diào)，隨肝纖維化加重，其表達(dá)量下調(diào)[8]。也有報(bào)道DC在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化降解作用的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)DC調(diào)節(jié)肝纖維化作用部分依賴(lài)于MMP- 9，當(dāng)小鼠缺失MMP- 9基因時(shí)，遷移的DC不能有效促進(jìn)肝纖維化的降解[9]。在復(fù)方861治療病毒性肝炎肝纖維化中MMP- 9表達(dá)量下調(diào),表明在肝纖維化消退過(guò)程中降解膠原的MMP- 9也隨之下調(diào)[10]。然而，鮮有報(bào)道脂聯(lián)素與MMP- 9之間的關(guān)系[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，重組的脂聯(lián)素載體轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞系(圖4)，重組表達(dá)的脂聯(lián)素能上調(diào)MMP- 9 mRNA的表達(dá)(圖2)和活性(圖3)，MMP- 9表達(dá)及活性上調(diào)能降解星狀細(xì)胞激活合成大量IV型膠原，提示上調(diào)脂聯(lián)素調(diào)節(jié)MMP- 9的表達(dá)及活性在阻抑肝纖維化進(jìn)程有潛在的研究?jī)r(jià)值。當(dāng)然，在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)方面的深入研究脂聯(lián)素的作用是十分必要的。

總之，脂聯(lián)素抗肝纖維化的具體機(jī)制等方面仍需要進(jìn)一步深入研究，對(duì)其機(jī)制的深入探討也許是揭示肝纖維化逆轉(zhuǎn)新的切入點(diǎn)。

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