孫 昭，趙 林，周 娜，高鶴麗，馬春亮，韓 欽

(中國醫(yī)學科學院 1.北京協(xié)和醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,北京 100730；2.基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 組織工程研究中心，北京 100005)

肝癌已成為全球第5種最常見的惡性腫瘤[1]，在中國肝癌發(fā)病率男性居第5位,女性居第6位；病死率男性居第2位,女性居第5位。因此肝癌在中國目前是僅次于肺癌的最主要惡性腫瘤,每年發(fā)病和死亡人數(shù)分別約36萬和35萬,并有繼續(xù)增高的趨勢[2]，研究肝癌的分子生物學標志物，可以為肝癌的預后的預測提供新的指標或者為肝癌的治療提供新的靶點。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子kruppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,其典型結(jié)構(gòu)特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，廣泛參與細胞的增殖、凋亡、分化等的調(diào)控。KLFs不僅在生理過程中有重要的作用，近來的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也起到重要的作用，KLF家族的新成員KLF17已經(jīng)在多種腫瘤中被證明為一種抑癌基因，其表達的下調(diào)和腫瘤的轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)。在胃癌[3]，肺癌[4]和乳腺癌[5]組織中KLF17的表達均低于癌旁的正常組織，而且在腫瘤組織中KLF17表達高的患者生存期更長。在既往的研究中[6- 7]發(fā)現(xiàn)KLF17在肝癌細胞系中可以通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進肝癌細胞的侵襲和遷移。為了進一步研究KLF17在肝癌中的作用，首先研究了KLF17在肝癌組織中的蛋白水平的表達和患者預后的關(guān)系，然后在肝癌原代培養(yǎng)的細胞中研究了KLF17的功能。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2009年1月至2011年12月在北京協(xié)和醫(yī)院肝膽外科手術(shù)的肝細胞肝癌者，經(jīng)病理科確診為肝細胞肝癌，全部為R0切除，有明確的隨訪結(jié)果，可以進行評估的患者一共36人，其中男性29人，女性7人；平均年齡55.2±11.5，(中位年齡56歲)；KPS分均≥80，根據(jù)巴塞羅那分期，A期 18人(50.0%)，B期13人(36.1%)，C期5人(13.9%)；病理低分化16人(44.4%)，中分化12人(33.3%)，高分化8人(22.3%)；甲胎蛋白≥400 U/mL的19人(52.8%)。隨訪截至2013- 06- 30，中位隨訪時間25個月。

1.2 免疫組合法檢測KLF17在肝癌組織中的表達

石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸緩沖液微波修復，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，山羊血清封閉，加抗KLF17的抗體(Genetex)，4 ℃過夜。加生物素標記的二抗，室溫下孵育60 min。加鏈霉素抗生物素，室溫下孵育30 min。DAB顯色，封片，在顯微鏡下觀察計數(shù)陽性細胞。免疫組合染色評分標準: 不著色0分, 淺棕色1分,棕色2分。陽性細胞所占比例評分標準: 陽性細胞數(shù)<10%者0分;10%～40%者1分;40%～70%者2分; ≥70% 者3分。兩種評分相加0～2分為低表達; 3～5分為高表達。

1.3 肝癌原代細胞系

Hep11和Hep12細胞系分別分離自同一肝細胞肝癌患者的原發(fā)灶和復發(fā)轉(zhuǎn)移灶(北京大學腫瘤醫(yī)院王歈博士贈送)。培養(yǎng)體系為RMPI1640培養(yǎng)基加20% FBS。

1.4 肝癌細胞侵襲和遷移實驗

肝癌細胞侵襲和遷移實驗在Transwell(Costa)小室中進行，侵襲實驗的小室預先鋪ECM膠。培養(yǎng)的細胞常規(guī)消化計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基重懸，200 μL的細胞懸液(1×106cells/mL)在轉(zhuǎn)染48 h后加入Transwell的上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基500 μL，分別在24和72 h后固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)。

1.5 RNA抽提和定量PCR檢測

Trizol法抽提總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，KLF17表達水平用定量PCR的SYBR法檢測，內(nèi)參為GAPDH。KLF17的引物序列為5′-CCAACCATTCAG CACTTTCCT-3′; 5′-AGTAGCTCATACCACGCTCAG-3′；GAPDH的引物序列為5′-GGTCACCAGGGCTGC TTTTA-3′; 5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3′。

1.6 蛋白質(zhì)提取和Western blot檢測

提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量，各組取40 mg總蛋白進行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上， KLF17一抗(Genentex)1∶1 000 4 ℃過夜，內(nèi)參為GAPDH(Santa Cruz)，二抗室溫孵育1 h，ECL熒光顯色，照相。

1.7 肝癌原代細胞Hep11的KLF17表達的干擾

KLF17的干擾的靶序列為5′-CGACAGTACCTT CTGACGAAAC-3′，轉(zhuǎn)染用Amaxa Nucleofector?核電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染，程序為T028。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件(版本19.0)，計量資料采用(均數(shù)±標準差)，計量資料用成組t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗或四格表確切概率檢驗，生存數(shù)據(jù)分析采用Kaplan-Meier法和壽命表法，組間比較采用Log-rank檢驗；對影響生存預后的聯(lián)合效應采用Cox回歸模型進行多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 KLF17在患者肝癌組織中的表達

在36名肝癌患者中，免疫組化檢測KLF17，其中有19人(52.8%)為3～5分，17人(47.2%)0～2分，KLF17免疫組化染色的結(jié)果見圖1，KLF17的表達和患者的性別，KPS評分，巴塞羅那分期，分化，AFP值等臨床特征無關(guān)。

2.2 Cox回歸分析各種危險因素對肝癌患者預后的影響

Cox回歸分析了性別，年齡，甲胎蛋白，分化程度，巴塞羅那分期，術(shù)后介入化療，KLF17表達對患者無進展生存(disease free survival，DFS)和總生存(overall survival,OS)的影響，其中巴塞羅那分期和KLF17對DFS和OS有影響，發(fā)現(xiàn)巴塞羅那分期在DFS的相對危險度(relative risk，RR)為3.1，P<0.05，KLF17 3～5分的RR為0.2，P<0.05，其他因素沒有統(tǒng)計學差異，而在OS中，巴塞羅那分期的RR為5.6，P<0.05，KLF17的RR是0.1，P<0.05，其他因素沒有統(tǒng)計學差異。

2.3 單因素分析KLF17對DFS和OS的影響

根據(jù)KLF17表達情況分為兩組， KLF17免疫組化評分0～2分的DFS為23.4±4.9個月(95%可信區(qū)間為13.2～32.3個月)，3～5分的DFS為39.3±4.2個月(95%可信區(qū)間為31.1～47.5個月)，P<0.05。KLF17評分為0～2分的OS為35.2±4.2個月(95%可信區(qū)間27.0～43.4個月)3～5分的OS為46.9±3.2(95%可信區(qū)間40.1～53.2個月)，KLF173～5分和0～2分的DFS和OS均有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 Hep11和Hep12肝癌細胞遷移和侵襲的比較

培養(yǎng)自肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)灶的Hep12的遷移和侵襲能力顯著高于Hep11(P<0.05, 圖2A，B)，而Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平均顯著低于Hep11(圖2C，D)。

2.5 Hep11細胞KLF17干擾后遷移和侵襲能力上調(diào)

Hep11細胞轉(zhuǎn)染KLF17的干擾序列后，定量PCR和Western blot檢測干擾有效(圖3A，B)，KLF17干擾組和無關(guān)序列干擾組比較遷移和侵襲能力顯著增加(P<0.05)(圖3C，D)。

3 討論

本研究首先用免疫組化法檢測了肝癌患者石蠟包埋保存的腫瘤組織中KLF17的表達，發(fā)現(xiàn)KLF17主要表達于肝癌細胞的細胞質(zhì)中，而KLF17的表達和患者的分期，分化，性別，甲胎蛋白等都沒有相關(guān)性，但是KLF17表達免疫組化評分高于3分的患者，無進展生存期和總生存期均較長，從而證實了KLF17在蛋白水平的表達和肝癌預后有顯著的相關(guān)性，這和以前報道的肝癌新鮮冰凍組織中KLF17mRNA表達較高的患者5年生存率更高的結(jié)果是一致的[6]。

為了進一步研究KLF17調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的機制，從同一患者原發(fā)灶和復發(fā)轉(zhuǎn)移灶分離出來的Hep11和Hep12原代培養(yǎng)的肝癌細胞被選中為研究對象，在體外研究中發(fā)現(xiàn)Hep12的遷移和侵襲能力顯著高于Hep11，而且Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平的表達均顯著低于Hep11，那么KLF17表達水平是否影響肝癌的侵襲遷移能力呢，進一步研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)KLF17表達后，Hep11遷移和侵襲能力顯著增強，從而證明KLF17在肝癌中確實具有調(diào)控轉(zhuǎn)移的功能。

A.negative; B.light brown; C.brown 圖1 肝癌的KLF17的免疫組化Fig 1 Immunohistochemistry of KLF17 inHepatocellular carcinoma(×400)

A.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 and Hep12; B.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep12 had greater migratory and invasive potentials than Hep11，*P<0.05 compared with Hep11; C.KLF17 protein expression in Hep11 and Hep12; D.KLF17 mRNA expression in Hep11 and Hep12,*P<0.05 compared with Hep11

圖2Hep11和Hep12遷移侵襲以及KLF17表達的比較
Fig2ComparisonofHep11andHep12characteristics(×200)

A.Western blot showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA; B.real time PCR showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA,*P<0.05 compared with control; C.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 transfected with KLF17 siRNA and control; D.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep11 cells that were transfected with the KLF17 siRNA (200 nmol/L) had greater invasive and migratory potentials than the control,*P<0.05 compared with control

圖3Hep11的KLF17干擾后侵襲和遷移增加
Fig3KLF17regulatedHep11cellmigrationandinvasion(×200)

總之，肝癌細胞質(zhì)高表達KLF17是肝癌預后較好的獨立預測因素之一，其機制可能是KLF17具有抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移的功能。

[1] Ferlay J, Shin HR, Bray F,etal. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010,127:2893- 2917.

[2] 陳建國, 陳萬青, 張思維,等.中國2003—2007年肝癌發(fā)病率與死亡率分析[J].中華流行病學雜志,2012：547- 553.

[3] Cai XD, Zhou YB, Huang LX,etal. Reduced expression of Krüppel-like factor 17 is related to tumor growth and poor prognosis in lung adenocarcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun, 2012,418:67- 73.

[4] Peng JJ, Wu B, Xiao XB,etal. Reduced Krüppel-like Factor 17 (KLF17) Expression Correlates with Poor Survival in Patients with Gastric Cancer[J]. ArchMed Res, 2014,45:394- 399.

[5] Gumireddy K, Li A, Gimotty PA,etal. KLF17 is a negative regulator of epithelial-mesenchymal transition and metastasis in breast cancer[J].Nat Cell Biol, 2009,11:1297- 1304.

[6] Liu FY, Deng YL, Li Y,etal. Down-regulated KLF17 expression is associated with tumor invasion and poor prognosis in hepatocellular carcinoma l[J].Med Onco, 2013，30:425- 432.

[7] Sun Z, Han Q, Zhou N,etal. MicroRNA- 9 enhances migration and invasion through KLF17 in hepatocellular carcinoma[J].Mol Oncol,2013,7:884- 894.