李元杰，張 蕾，隋 御，徐 方*

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 2.生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧夏 銀川 750004)

化療在中晚期癌癥的治療及預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中具有十分重要的地位，在臨床上，傳統(tǒng)的化療方案被普遍應(yīng)用于不同種類的癌癥治療中，由于化療藥物缺乏特異性，因而導(dǎo)致臨床使用的藥物濃度相對(duì)較高，往往會(huì)對(duì)患者機(jī)體帶來極大的損傷，隨著化療過程的推進(jìn)，多種藥物聯(lián)合使用，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)也就隨之出現(xiàn)，繼而成為制約惡性腫瘤治療的最大的難題[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們期望通過分子生物學(xué)手段靶向干預(yù)目的基因表達(dá)，以此來實(shí)現(xiàn)耐藥性逆轉(zhuǎn)。國內(nèi)外研究顯示，跨損傷合成途徑(translesion DNA Synthesis, TLS)與細(xì)胞突變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，同時(shí)與鉑類藥物耐藥的分子機(jī)制密切相關(guān)[3]。由此，本實(shí)驗(yàn)選擇了TLS途徑的關(guān)鍵基因REV3和MMS2作為目的基因，運(yùn)用 RNAi 技術(shù)下調(diào)目的基因在人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞系(THC8307/L-OHP)中的表達(dá)，探討TLS與鉑類耐藥逆轉(zhuǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞系(THC8307)及人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞系(THC8307/L-OHP)(天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室湯華教授建立并惠贈(zèng))，攜帶GFP(綠色熒光蛋白)的實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-REV3, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2及陰性質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP(上海松正生物公司)；注射用奧沙利鉑(L-OHP，南京制藥廠)；LipofectamineTM2000(Invitrogene公司)；四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)(Sigma公司)；REV3、MMS2基因引物(上海生工生物工程有限公司)；引物序列見表1；MMS2一抗(Abcam 公司)、REV3一抗(Santa Cruz Biotechnology)；MMS2二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、REV3二抗(Jackson公司)；四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)、Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、DAPI染色試劑盒(均南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：THC8307(親本系)常規(guī)培養(yǎng)，THC8307/L-OHP(耐藥系)需加入6 μg/mL的奧沙利鉑維持其耐藥性。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行：1)THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)照組；2)轉(zhuǎn)染液與陰性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR)混合液；3)REV3和MMS2基因按1∶1混合干擾質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染液混合液。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 qRT-PCR:按上述分組處理THC8307/L-OHP細(xì)胞后，于 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h 后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞形態(tài)變化。1 000 r/min離心收集上述各組細(xì)胞，PBS洗滌2～3 次后，按總RNA抽提試劑盒說明書操作提取RNA，轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。MMS2基因PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。REV3基因PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，93 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。3次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過比較CT 值法(2-△△CT) 進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.3 免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染后THC8307/L-OHP細(xì)胞MMS2蛋白和REV3蛋白表達(dá)的變化：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將上述各組細(xì)胞爬片于6孔板中，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min，0.5% TritonX-100對(duì)細(xì)胞透化處理10 min，PBS洗3遍，每次5 min，封閉液封閉30 min，PBS洗3遍，同時(shí)加入1∶200兔抗人MMS2抗體和山羊抗人REV3抗體，4 ℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min之后加入兩基因的熒光二抗(1∶100稀釋)，37 ℃，孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min，加入0.5μg/mL DAPI染色10 min，PBS洗3遍，在避光條件下，1 h內(nèi)熒光倒置顯微鏡拍照分析結(jié)果。(REV3基因運(yùn)用橙紅色熒光標(biāo)記二抗，MMS2基因運(yùn)用綠色熒光標(biāo)記二抗)。

1.2.4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性：取THC8307及轉(zhuǎn)染24 h后的THC8307/L-OHP各組細(xì)胞5×104/mL接種于96孔板中，設(shè)終濃度為0.06、0.6、6、60 和600 mg/L藥物濃度梯度，100 μL/孔。培養(yǎng)48 h后，按MTT試劑盒操作，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測A490值，取5個(gè)復(fù)孔的平均吸光度(A)值，每組重復(fù)3次，根據(jù)吸光度報(bào)告(A值)計(jì)算藥物半數(shù)抑制率(IC50)、耐藥系數(shù)(Resistance Index，RI)和相對(duì)逆轉(zhuǎn)率。

1.2.5 Rh123單染法檢測細(xì)胞凋亡：在鋪有玻片的6孔板中按4×105個(gè)/孔接種THC8307/L-OHP細(xì)胞，24 h后按上述分組處理細(xì)胞，再培養(yǎng) 24 h 后收獲細(xì)胞懸液，按試劑盒染色細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，IPP6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染后THC8307/L-OHP細(xì)胞聯(lián)合L-OHP的凋亡率：取對(duì)數(shù)生長期的THC8307/L-OHP細(xì)胞，調(diào)整濃度至 4×105/ mL，接種于 6 孔板，轉(zhuǎn)染 24 h 后按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入終濃度為60 mg/L L-OHP，置于 37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，分別收集各處理組細(xì)胞，按操作說明采用AV/PI雙染，避光放置10 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干擾效能的鑒定

2.1.1MMS2和REV3在細(xì)胞中表達(dá)的變化：轉(zhuǎn)染含miRNA實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒的THC8307/L-OHP細(xì)胞MMS2和REV3的表達(dá)量低于空白組和陰性組(P< 0.05)。小RNA干擾片段成功抑制實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMS2和REV3基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染試劑對(duì)MMS2和REV3基因表達(dá)無大影響(圖1)。

2.1.2 RNAi基因蛋白水平測定：實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組相比，REV3蛋白和MMS2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表2)，在蛋白水平上證明實(shí)驗(yàn)組兩基因成功下調(diào)(圖2)。

表2 各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度Table2 Mean density of each group(±s, n=3)

*P<0.05 compared with control group.

2.2 下調(diào)基因?qū)HC8307/L-OHP細(xì)胞耐藥性的影響

基因下調(diào)組與兩對(duì)照組比較，RI值明顯降低，且相對(duì)逆轉(zhuǎn)率明顯增高(P<0.05)(表3)。

2.3 基因下調(diào)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 羅丹明123熒光染色：同一視野和曝光率下，各組細(xì)胞熒光照片可見空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整,染色均勻；陰性對(duì)照組與空白組細(xì)胞形態(tài)相仿，實(shí)驗(yàn)組多為凋亡細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)殘缺，染色不均勻(圖3)，基因下調(diào)組平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)于空白組和陰性對(duì)照組(P<0.05)(表4)。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V-FITC/PI熒光染色結(jié)果：經(jīng)L-OHP處理16 h后，轉(zhuǎn)染組凋亡率高于空白組和陰性對(duì)照組 (圖4，表5)。

*P<0.05 compared with control groups 圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定基因表達(dá)圖Fig 1 Gene expression testing by qRT-PCR(±s, n=3)

圖2 各組細(xì)胞的免疫熒光染色Fig 2 Immunofluorescence staining of each group(×400)

groupIC50(μg/L)RIrelativereversal(%)THC830772±16——THC8307/L?OHPblank1904±2512655—THC8307/L?OHPcontrol1858±2002591251THC8307/L?OHPREV3↓MMS2↓459±27?682?7886?

*P<0.05 compared with control group.

表4 各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度Table 4 Mean density of each group(±s,%，n=3)

*P<0.05 compared with control group.

3 討論

結(jié)腸癌作為一種多基因遺傳病，其發(fā)生發(fā)展是多基因參與的多步驟復(fù)雜過程，針對(duì)單一基因的治療往往無法達(dá)到預(yù)期療效，多靶點(diǎn)聯(lián)合沉默腫瘤相關(guān)基因的治療思路可能更具發(fā)展?jié)摿4]。以往的研究已證實(shí)跨損傷DNA合成途徑，尤其是DNA pol-ζ，其作為去除DNA交連損傷的關(guān)鍵，成為腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)[5- 6]，也是鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵。因此，通過抑制 DNA 聚合酶ζ，或者跨損傷修復(fù)途徑中的關(guān)鍵基因，將會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于鉑類化療藥物的敏感性[3]。國內(nèi)外研究學(xué)者通過單一阻斷REV3基因，或者聯(lián)合阻斷REV3基因與P53基因，證實(shí)REV3基因可逆轉(zhuǎn)卵巢癌、肺癌等多種腫瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性[7- 8]。本實(shí)驗(yàn)前期體外實(shí)驗(yàn)也證明單一下調(diào)REV3基因的表達(dá)，可以反轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，但是同時(shí)阻斷跨損傷修復(fù)途徑中無誤性修復(fù)通路與易誤性修復(fù)通路中的關(guān)鍵基因是否也能產(chǎn)生此效應(yīng)，尚未見到報(bào)道。

圖3 Rh123熒光顯微鏡圖Fig 3 Rh123 testing by fluorescence microscope(×400)

表5 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率

*P<0.05 compared with control group.

REV3基因編碼跨損傷修復(fù)途徑易誤性通路中DNA聚合酶ζ的催化亞基，MMS2基因是無誤性通路的關(guān)鍵基因，本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)聯(lián)合降低了人耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞中跨損傷修復(fù)的關(guān)鍵基因，采用MTT方法評(píng)價(jià)其對(duì)L-OHP的敏感性變化，與對(duì)照組相比，L-OHP對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50顯著降低，表明聯(lián)合下調(diào)REV3和MMS2基因可以增加THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在相同L-OHP作用下，REV3和MMS2基因表達(dá)受抑制后，可以促進(jìn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自發(fā)凋亡，結(jié)果提示由TLS介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥過程中可能有凋亡機(jī)制的參與，這與TLS與P53凋亡通路密切相關(guān)的報(bào)道一致[10]。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，聯(lián)合阻斷REV3和MMS2基因的表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性，在一定程度上恢復(fù)了耐藥細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性，從而進(jìn)一步證實(shí)了TLS與逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性存在一定的因果關(guān)系[11]。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)基因?qū)o予L-OHP處理的THC8307/L-OHP細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 The effect of gene intefering on apoptosis of THC8307/L-OHP cells detected by flow-cytometric

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