陳璐勔，羅艷琳，趙 麗，韓 松，李淑娟，李俊發(fā)*

(首都醫(yī)科大學1.神經(jīng)生物學系 北京腦重大疾病研究院，北京100069；2.附屬北京朝陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100020)

自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，并被認為是細胞進行自我保護的一種重要機制[1]。關(guān)于自噬在腦缺血和缺血再灌注過程中的作用一直存在爭議，一些研究者認為自噬在腦缺血損傷中起到保護作用；而另一些學者則認為自噬加重腦缺血損傷。究其原因，可能主要與研究者所選擇的實驗?zāi)Ｐ陀嘘P(guān)，即缺血/低氧或再灌注時間的差異可能造成不同的實驗結(jié)果。如在大鼠腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型與原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，自噬在缺血/再灌注中起保護作用，且這種保護作用不因再灌注時間的長短而改變[2- 4]。然而，其他研究者在不同實驗條件下發(fā)現(xiàn)，隨著氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)時間的延長，自噬逐漸對細胞起損害作用[5- 6]。這些研究結(jié)果提示，缺血/低氧程度可能對于研究細胞自噬在腦缺血性損傷中作用有重要意義。據(jù)此，本實驗擬利用原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模擬離體缺血模型，選擇不同OGD強度并利用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(BafA1)，探討細胞自噬在OGD誘導(dǎo)神經(jīng)元缺血損傷中作用，并為深入研究神經(jīng)元在不同缺血強度狀態(tài)下，自噬的具體細胞信號激活機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級， 出生24 h內(nèi)的C57BL/6J乳鼠，雌雄不拘。購于首都醫(yī)科大學動物部，SCXK(京)2012- 0001。

1.2 主要試劑

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)和無糖DMEM(Gibco公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，兔源性LC3多克隆抗體，Bafilomycin A1(Sigma-Aldrich公司)，兔源性Beclin- 1多克隆抗體和鼠源性β-actin單克隆抗體(Proteintech公司)，CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒(Promega公司), 3-(4,5-二甲基噻唑-2)- 2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Applichem公司)。

1.3 神經(jīng)元氧-糖剝奪(OGD)模型制備

選用培養(yǎng)8 d生長狀態(tài)良好的神經(jīng)元，更換為無糖培養(yǎng)基，放入37 ℃、通有混合氣體(5% CO2, 2% O2和93% N2)的低氧培養(yǎng)箱。分別于15、30、60、90和120 min后取出，更換為正常培養(yǎng)液，并置于37 ℃、5% CO2飽和的常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。為明確自噬在神經(jīng)元OGD損傷中的作用，自噬抑制劑BafA1在細胞進行OGD前即刻加入，并在細胞培養(yǎng)基中保持終濃度為100 nmol/L。

1.4 Western blot檢測

蛋白樣品制備、SDS-PAGE和Western blot參照文獻[14]。提取全細胞蛋白、BCA法定量。取30 g蛋白樣品，進行電泳(12% SDS-PAGE,4 ℃,20～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,400 mA,1 h)。先后用兔源性抗Beclin- 1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(1∶4 000)進行免疫雜交；然后用ECL發(fā)光，X-線片曝光、顯影、定影。Western blot結(jié)果用Quantity One軟件進行定量分析。

1.5 MTT比色法

將細胞接種于96孔板，經(jīng)OGD處理后加入MTT，并避光37 ℃溫浴4 h。MTT可被線粒體內(nèi)脫氫酶還原生成結(jié)晶狀深紫色產(chǎn)物甲臜(formazan)，用DMSO將其完全溶解后，通過酶標儀測定490 nm波長的吸光度(A490)，來計算細胞存活率。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率

在96孔板接種細胞，按照CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒規(guī)定步驟，定量測量(A490)細胞LDH漏出率，來確定細胞損傷水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 OGD處理對原代培養(yǎng)腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin- 1表達水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

經(jīng)15～120 min OGD/復(fù)糖復(fù)氧(R)24 h處理后，原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)Beclin- 1蛋白表達水平隨OGD處理時間延長顯著升高，且于30 min達到峰值1.80±0.08倍 (P<0.05) (圖1)。同樣，代表自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在OGD處理后15～120 min的變化趨勢與Beclin- 1蛋白表達水平相似，均在30 min OGD處理后達到峰值1.60±0.02倍 (P<0.05) (圖2)。

2.2 自噬抑制劑BafA1對OGD處理神經(jīng)元內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達和缺血損傷的影響

選取自噬最為活躍的時間點，OGD 30和60 min/R 24 h，觀察神經(jīng)元損傷情況。MTT結(jié)果(圖3A)示，30和60 min OGD/R 24 h神經(jīng)元的存活率分可使神經(jīng)元死亡率分別為(33.1±1.9)%和(39.9±1.4)%。然而，在終濃度100 nmol/L自噬抑制劑BafA1作用下，60 min OGD/R 24 h處理的神經(jīng)元存活率下降為(49.3±1.5)%，較單純60 min OGD/R 24 h處理神經(jīng)元的存活率顯著下降(P<0.05)，同樣，LDH漏出率結(jié)果顯示，BafA1抑制自噬后，30和60 min OGD/R 24 h處理神經(jīng)元死亡率分別增加至(36.8±0.6)%和(51.2±1.5)%，且60 min OGD/R 24 h組神經(jīng)元死亡率顯著增加 (P<0.05) (圖3B)。此外，進一步明確了BafA1對OGD處理神經(jīng)元存活率和死亡率的影響是通過對細胞自噬的抑制作用(P<0.05) (圖4)。

A.the typical result of Western blot showed the changes of Beclin- 1 (60 ku) expression in primary cultured cortical neurons with oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the Beclin- 1 expression increased;*P<0.05 conpared with 0 min OGD (normoxic control)

圖1不同OGD處理時間對原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)Beclin-1表達水平的影響
Fig1EffectofOGDexposuretimeonBeclin-1expressionlevelinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

A.the typical result of Western blot showed the changes of LC3Ⅰ (17 ku) and LC3Ⅱ (14 ku) expressions in primary cultured cortical neurons with OGD treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ increased significantly with OGD exposure time；*P<0.05 compared with 0 min OGD (normoxic control)

圖2不同OGD處理時間對原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響
Fig2EffectofOGDexposuretimeonLC3Ⅱ/Ⅰratioinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

3 討論

細胞自噬在腦缺血病理生理變化中扮演著重要的角色，明確自噬在腦缺血中發(fā)揮的作用是挽救缺血性腦卒中患者生命的關(guān)鍵[7- 10]。OGD致離體細胞缺血模型可解決整體動物實驗難以解決的問題，并避免了諸多體內(nèi)因素的干擾，非常便于觀察藥物的作用， 以及進一步探討保護或損傷的細胞分子機制。

A.the results of MTT(cell survival); B.LDH(cell death) assaies demonstrated that autophagy inhibitor BafA1could significantly aggravate 60 min OGD/24 h R-induced ischemic injury in primary cultured cortical neuron of mice;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60min OGD without BafA1treatment

圖3自噬抑制劑BafA1對30～60minOGD處理神經(jīng)元缺血性損傷的影響

Fig3EffectofautophagyinhibitorBafA1on30～60minOGD-inducedischemicinjuriesinprimaryculturedcorticalneuronofmice(n=6)

The results of typical Western blot and quantitative analysis showed that the autophagy inhibitor BafA1, which is a specific inhibitor of vacuolar H+ ATPase to prevent the fusion between autophagosomes and lysosomes, could significantly induce the accumulation of LC3II in primary cultured cortical neurons after 60 min OGD/24 h R;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60 min OGD

圖4自噬抑制劑BafA1對60minOGD處理神經(jīng)元內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

Fig4EffectofautophagyinhibitorBafA1ontheLC3Ⅱ/Ⅰrationinprimaryculturedcorticalneuronsafter60minOGDtreatment(n=6)

因此，原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型，可研究缺血/缺氧時神經(jīng)元自噬是否被激活及其激活程度，更重要的是能更直接地研究神經(jīng)元自噬在缺血/缺氧性損傷中作用，為深入研究腦缺血/低氧性損傷和適應(yīng)機制打下了良好基礎(chǔ)[11- 14]。本研究結(jié)果表明，離體培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)OGD/24 h R處理后， OGD1 5 min即可誘發(fā)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的自噬發(fā)生，OGD 30 min即可使神經(jīng)元內(nèi)自噬水平達到峰值，然而隨著時間的延長，神經(jīng)元自噬水平略微下降，損傷情況加重，提示神經(jīng)元的損傷方式可能已發(fā)生了改變，即凋亡和壞死途徑被觸發(fā)。而細胞自噬可緩解OGD致小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺血性損傷，并在60 min OGD/R 24 h的保護作用更明顯。

總之，本實驗在原代培養(yǎng)神經(jīng)元的缺血性損傷中證實，自噬可以對抗OGD致神經(jīng)元的損傷作用，且這種作用與時間密切相關(guān)，隨著OGD時間的延長，其他細胞死亡方式被觸發(fā)，自噬的保護作用被削弱。提示臨床上治療缺血性腦卒中不僅要在合適的時間點發(fā)揮自噬的保護作用，還要注意抑制其他細胞死亡方式的發(fā)生。總之，OGD可誘發(fā)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元自噬發(fā)生，且細胞自噬可緩解OGD處理腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺血損傷。

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