黃華如 梁凱光 蟻珩鑫 梁雪蓮

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510225）

隨著人類人口的激增，對(duì)糧食的需求不斷增加，甜玉米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值逐漸被人們接受認(rèn)可，甜玉米的種植在世界范圍得到迅速發(fā)展。根據(jù)玉米的遺傳類型和胚乳特性，甜玉米可分為3 種：普通甜玉米、超甜型甜玉米（又稱水果甜玉米）和加強(qiáng)型甜玉米［1］。2007 年，廣東省的甜玉米面積達(dá)到13.0 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量170.82 萬(wàn)t，云南省種植面積約為3.5 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量45.00 萬(wàn)t；廣西種植面積3.2 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量39.8萬(wàn)t，浙江省甜玉米發(fā)展勢(shì)頭也較好，種植面積達(dá)1.1萬(wàn)hm2，產(chǎn)量13.6 萬(wàn)t［2］。隨著甜玉米產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，甜玉米品種也不斷更新?lián)Q代，科研人員利用各種先進(jìn)育種技術(shù)不斷研發(fā)出新品種，為甜玉米的開發(fā)利用不斷增加新的種質(zhì)資源，提高甜玉米的產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)為科研人員開發(fā)利用甜玉米資源提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。目前，主要利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP 四種分子標(biāo)記技術(shù)研究玉米的遺傳多樣性。研究表明，SSR分子標(biāo)記是目前最適合于分析玉米種質(zhì)遺傳多樣性及劃分雜種優(yōu)勢(shì)群的分子標(biāo)記技術(shù)［3］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple sequence repeat，SSR），又稱為微衛(wèi)星 DNA（Microsatellite DNA）。其操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，已被廣泛用于遺傳多樣性分析、構(gòu)建遺傳圖譜等研究領(lǐng)域。李新海等［4］利用SSR 標(biāo)記技術(shù)用64 對(duì)擴(kuò)增帶型穩(wěn)定的引物研究了70 份我國(guó)主要玉米自交系的遺傳變異，從中檢測(cè)出等位基因數(shù)目為248 個(gè)，結(jié)合多態(tài)性信息將70 份玉米劃群，得出劃群結(jié)果與其系譜分析和育種家經(jīng)驗(yàn)基本相符。黃君等［5］利用SSR 標(biāo)記對(duì)54 份甜玉米自交系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從150 對(duì)引物中篩選出了56 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物，分析每份玉米之間的遺傳特性。本試驗(yàn)利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)和聚類分析法分析我國(guó)16 種甜玉米的遺傳特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 選用目前我國(guó)各地大量種植的代表性甜玉米品種，共16 份。具體材料見表1。

表1 甜玉米品種及來源

1.1.2 試劑 微衛(wèi)星標(biāo)記引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，EDTA、DNA Taq 聚合酶和SDS 等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 設(shè)備 DYY-6C 型垂直板電泳儀（北京市六一儀器廠），小型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf 公司），DG-3C 型水平電泳槽、DY6040 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，UV-254 暗箱式紫外透射儀（北京鼎國(guó)公司），DNA 凝膠分析儀（美國(guó)GDS-800UVP），PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)PTC-200），ALC210.4 電子分析天平（廣州市正一科技有限公司），手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜玉米基因組DNA 的提取 根據(jù)SDS 法進(jìn)行DNA 提取，產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 引物篩選 微衛(wèi)星標(biāo)記引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，從200 對(duì)引物中篩選出10 對(duì)多態(tài)性較好的引物，引物篩選步驟如下：以金帥和皖甜1 號(hào)玉米品種的基因組DNA 為模板，更換不同的特異引物，建立以下PCR 反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，包括金帥DNA 模板1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，正向、反向引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，用ddH2O 調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72℃延伸10 min。

1.2.3 SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè) 將20 mL 12%濃縮膠貯藏液、重蒸水20 mL、10%過硫酸銨0.4 mL，TEMED 15 μL，混合均勻后，溶液倒入兩玻璃板之間，膠凝固后進(jìn)行電泳，預(yù)電泳15-30 min，在10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5 μL 10×loading buffer，混勻，電泳。電泳后將凝膠板放入10%的冰乙酸中，輕搖至凝膠指示劑無(wú)色，約30 min。換用蒸餾水洗2 次，每次1-2 min 后，然后放入0.1%染色液中，輕搖15-20 min。再用蒸餾水洗2 次，各1 min，立刻放入預(yù)冷的顯影液，輕搖至DNA 條帶出現(xiàn)，約5 min，將顯影好的凝膠板用蒸餾水洗2 次，水中保存，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并照相。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù) SSR 產(chǎn)物銀染結(jié)果在相同遷移率位置上（相同的分子量片段），有帶記為1，無(wú)帶記為0，缺失記為9［6］。每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性含量（PIC），按Smith 等［7］的公式計(jì)算，PIC=1-∑f2

i，其中fi 為i 位點(diǎn)的基因頻率，數(shù)據(jù)處理由統(tǒng)計(jì)分析軟件LittlePrograme 完成。采用 Nei 等［8］的公式計(jì)算各自交系間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS）和遺傳距離（Genetic distance，GD）：GS= 2Nij/（Ni+Nj）；GD =1-GS. 其中，Nij 為第 i 個(gè)和第 j 個(gè)材料基因型間共有的條帶數(shù)；Ni 和 Nj 分別為第 i 個(gè)和第 j 個(gè)材料各自的特有條帶數(shù)。聚類分析按UPGMA方法對(duì)各個(gè)自交系進(jìn)行聚類作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用NTSYSpc-2.10e 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 玉米總DNA電泳圖譜

利用SDS 總基因提取法提取16 種甜玉米的總DNA，并在0.8%瓊脂糖電泳中檢測(cè)，得出16 種玉米DNA 條帶。部分甜玉米品種的DNA 電泳（圖1）顯示，DNA 條帶的亮度很好，但是尾部的亮點(diǎn)比DNA 條帶亮度亮，說明所提取的DNA 里含有雜質(zhì)。由于SSR 標(biāo)記具有較高的靈敏性，所檢測(cè)的DNA 需要微量即可，故將所提取的DNA 低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 部分甜玉米電泳圖

2.2 引物篩選結(jié)果

以金帥和皖甜1 號(hào)玉米品種的基因組DNA 為模板，分別用200 對(duì)引物按1.2.3 中所述方法進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳。根據(jù)瓊脂糖電泳圖所顯示出的條帶清晰度和等位基因數(shù)的多少篩選出10 對(duì)引物。圖2 是部分引物篩選結(jié)果。

圖2 引物篩選圖譜

2.3 SSR結(jié)果分析

2.3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 在銀染后拍照，得出16 種甜玉米的指紋圖譜，從圖3 可以清晰的看到帶譜，但片段數(shù)目較多，統(tǒng)計(jì)時(shí)有些困難。可能是由于退火溫度沒有調(diào)好，造成較多的帶出現(xiàn)，但條帶清晰，對(duì)結(jié)果不會(huì)造成較大影響。圖3 為16 種甜玉米在引物6-10 中擴(kuò)增的指紋圖譜。

圖3 16 種甜玉米指紋圖譜

2.3.2 分子標(biāo)記結(jié)果 表2 是16 種甜玉米在10 對(duì)引物下擴(kuò)增得到的總片段數(shù)目。結(jié)果顯示，16 種甜玉米擴(kuò)增總片段數(shù)范圍在117-174，平均為151 條，其中特大甜出現(xiàn)的片段數(shù)最少，只有117 條，農(nóng)大超甜最多，達(dá)174 條。

10 對(duì)SSR 引物在16 份甜玉米品種中共檢測(cè)出254 個(gè)等位基因位點(diǎn)（表3），檢測(cè)出的等位基因位點(diǎn)變幅為5-38 個(gè)，平均每對(duì)引物檢測(cè)出25.4個(gè)，引物39 檢測(cè)出的等位基因位點(diǎn)數(shù)最少，不能把16 個(gè)甜玉米品種區(qū)分開。每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）變化為0.681 7-0.968 7，平均為0.920 8；其中引物10-8 位點(diǎn)的PIC 最大為0.920 8，引物39 位點(diǎn)的PIC 最小為0.691 7。PIC 值的大小與于檢測(cè)到的等位基因數(shù)目及基因頻率有關(guān)，反映了SSR 引物是否能把某一品種與其他品種分開的能力。

表2 16 種甜玉米擴(kuò)增片段總數(shù)

表3 10 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3.3 遺傳相似性分析 利用NTSYS2.10e 版本軟件，計(jì)算材料之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍。經(jīng)計(jì)算得出16 個(gè)玉米品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.241 3-0.964 3 之間，表明品種間遺傳差異相對(duì)較大，遺傳多樣性較高。其中金銀818 和農(nóng)大超甜的遺傳相似系數(shù)最大為0.964 3，品種之間的相似系數(shù)大于 0.90 的共有5 對(duì)：秦龍?zhí)?、香? 號(hào)，皖甜1 號(hào)、華寶1 號(hào)，金銀818、超甜2000 及農(nóng)大超甜、超甜2000，農(nóng)大超甜、金銀818，說明它們之間有很高的相似性；超甜2000 和特大甜的遺傳相似系數(shù)最小為0.241 3，說明這兩個(gè)品種的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，遺傳差異相對(duì)較大，具有較高的多樣性。表4、表5顯示，16 個(gè)甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)變異較大，遺傳多樣性較豐富。

表4 16 個(gè)甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)

表5 其中8 個(gè)甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)

2.3.4 SSR 聚類分析 使用軟件NTSYSpc V2.10e 對(duì)16 份玉米材料進(jìn)行聚類分析，用Qualitative data 生成16 種甜玉米之間的樹行圖（圖4）。根據(jù)聚類分析樹狀圖，以相似系數(shù)0.753 為標(biāo)準(zhǔn)，可以將16 種甜玉米聚分為3 類群。第一類群包括金帥和特大甜，共2 個(gè)品種；第二類群有10 個(gè)玉米品種，在相似系數(shù)0.794 處又可以分為2 個(gè)亞類：秦龍?zhí)稹⑼钐?號(hào)、美珍204、東方甜1 號(hào)及金黃超甜聚為一個(gè)亞類；香甜1 號(hào)、超甜2000、農(nóng)大超甜、上海甜及綠色超人聚為另一個(gè)亞類，說明它們親緣關(guān)系較近，但也有一定的遺傳差異。第三類群包括華威6 號(hào)、華寶1 號(hào)、金銀818 及粒粒香甜。第一類群由2 個(gè)品種聚成，說明它們與其他材料之間遺傳距離比較遠(yuǎn)。第二類中的超甜2000 和農(nóng)大超甜之間的相似系數(shù)最接近，變異系數(shù)較小，親緣性較大。根據(jù)雜種優(yōu)勢(shì)原理，可以選用遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的材料來雜交。16 種甜玉米分為3 大類，遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，可以選用3 大類之間的品種進(jìn)行雜交，其中第一類的金帥和特大甜與其他品種進(jìn)行雜交的優(yōu)勢(shì)會(huì)更明顯。

圖4 16 種甜玉米的聚類圖

3 討論

本試驗(yàn)從200 對(duì)引物中篩選出10 對(duì)SSR 引物對(duì)16 種甜玉米進(jìn)行遺傳特性分析。經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，共檢測(cè)到254 個(gè)等位基因，平均25.4 個(gè)，平均PIC值為0.920 8。這一結(jié)果無(wú)論是平均等位基因數(shù)還是平均PIC 值都高于李新海等［9］的甜玉米的PIC 值（0.511）。遺傳相似系數(shù)從 0.241 3 到 0.964 3，平均為0.602 8，表明16 個(gè)甜玉米品種間遺傳差異相對(duì)較大，遺傳多樣性較高。以相似系數(shù)0.753 為標(biāo)準(zhǔn)，可以將16 種甜玉米聚為3 類群。本試驗(yàn)表明，SSR 分析對(duì)DNA 純度要求不高，且?guī)头€(wěn)定，多態(tài)性豐富，同時(shí) SSR 標(biāo)記有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低等優(yōu)點(diǎn)［10］。本試驗(yàn)的16 個(gè)甜玉米品種的遺傳相似系數(shù)在 0.241 3-0.964 3 之間，平均為0.602 8，說明多數(shù)材料間具有一定的遺傳差異，但總體材料遺傳基礎(chǔ)相對(duì)比較狹窄，這可能與選材范圍不夠廣泛及核心SSR 引物的篩選有關(guān)。試驗(yàn)中總DNA 的提取、核心引物的篩選、SSR 技術(shù)操作的成熟度均會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響，所以尋找到一種快速有效的方法是得出正確結(jié)果的重要因素［11］。利用SSR 分子標(biāo)記和聚類分析手段，可以對(duì)不同物種的遺傳距離、親緣關(guān)系等進(jìn)行分析。從而確定物種之間的遺傳距離，進(jìn)而進(jìn)行種群分類。趙瑞芳等［12］利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)研究了12 個(gè)玉米品種間的遺傳關(guān)系，聚類分析結(jié)果表明，12 個(gè)玉米品種間的聚類劃群結(jié)果與玉米品種的系譜來源基本一致。

4 結(jié)論

在本次試驗(yàn)中將供試的16 個(gè)甜玉米品種劃分為3 個(gè)類群，聚類結(jié)果與16 個(gè)甜玉米品種的種植區(qū)域基本一致。結(jié)果再次證明利用 SSR 標(biāo)記進(jìn)行甜玉米品種間的遺傳特性分析及種群分類是可行的。

［1］ 沈雪芳, 鄭洪建, 候根寶, 等. 我國(guó)甜玉米育種和生產(chǎn)現(xiàn)狀分析［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22（3）：112-116.

［2］ 潘藝, 張祿祥, 萬(wàn)忠. 2008 年度廣東省甜玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009（3）：187-190.

［3］ 袁力行, 傅駿華, 劉新芝, 等. 利用分子標(biāo)記預(yù)測(cè)玉米雜種優(yōu)勢(shì)的研究［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 33（6）：6-12.

［4］ 李新海, 袁力行, 李曉輝, 等. 利用SSR 標(biāo)記劃分70 份我國(guó)玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)群［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36（6）：622-627.

［5］ 黃君, 馮發(fā)強(qiáng), 王青峰, 等. 54 份甜玉米自交系的SSR 遺傳多樣性分析［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 33（1）：1-4.

［6］ 王利鋒, 李會(huì)勇, 唐保軍, 等. 20 份特異玉米地方品種的SSR遺傳多樣性分析［J］. 華北農(nóng)學(xué), 2009, 24（1）：125-127.

［7］ Smith JSC, Chin ECL, Shu H, et al. An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize（Zea mays L.）：Comparisons with data from RFLPS and pedigree［J］. Theor Appl Genet, 1997（95）：163-173.

［8］ Nei M, Li WH. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］. Proc Natal Accad Sic, 1979, 76（10）：5269-5273.

［9］ 李新海, 傅駿驊, 張世煌. 利用SSR 標(biāo)記研究玉米自交系的遺傳變異［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 33（2）：1-9.

［10］ 鐘昌松, 徐利遠(yuǎn), 余桂蓉, 等. 20 份特用玉米自交系親緣關(guān)系的SSR 標(biāo)記研究［J］. 玉米科學(xué), 2006, 14（4）：43-46.

［11］ 陳坤, 楊昌河. 48 份糯玉米自交系遺傳多樣性的SSR 標(biāo)記［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38（1）：1-3.

［12］ 趙瑞芳, 侯本軍, 庫(kù)麗霞, 等. 利用SSR 標(biāo)記分析12 個(gè)玉米群體的遺傳關(guān)系［J］. 玉米科學(xué), 2012, 20（2）：33-36.