江偉華 劉益麗 江明鋒

（青藏高原研究院 動物遺傳育種國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041）

質(zhì)粒穩(wěn)定性是影響基因工程菌外源蛋白表達的重要因素，同時外源蛋白的表達又影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。隨著DNA 重組技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)在科研工作和應(yīng)用生產(chǎn)中占據(jù)著越來越重要的位置。目前，關(guān)于質(zhì)粒穩(wěn)定性及其改良的論述仍比較少見，且不夠全面。自20 世紀70 年代以來，大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳背景清楚，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，成本低廉，生長繁殖快，結(jié)構(gòu)簡單，培養(yǎng)操作簡便，可以大規(guī)模地快速生產(chǎn)目的蛋白，加之其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其他基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的30%，因而大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。

在大腸桿菌中，通常應(yīng)用質(zhì)粒載體進行外源基因表達，質(zhì)粒穩(wěn)定性對于質(zhì)?；虍a(chǎn)物的高表達水平是必需的。在實際應(yīng)用中，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，成為限制外源蛋白在大腸桿菌中高效表達的瓶頸之一。包含外源基因的質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌中常常會帶來一系列的生理負擔，影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。重組表達質(zhì)粒的不穩(wěn)定性主要包括結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、分配不穩(wěn)定性以及異構(gòu)體不穩(wěn)定性3種情況。通常，質(zhì)粒的不穩(wěn)定性或者是由質(zhì)粒自身變化造成的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性引起，或者是由分配不穩(wěn)定性引起。研究表明，質(zhì)粒的不穩(wěn)定性由許多因素決定，如質(zhì)粒的裝載、質(zhì)粒的拷貝數(shù)、復(fù)制模式、底物類型、培養(yǎng)基組分、宿主背景、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)溫度等（表1）。

表1 質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響因素

1 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性

1.1 大腸桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的產(chǎn)生

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性主要指的是其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，而結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性通常被看作是質(zhì)粒本身非常規(guī)重組的結(jié)果。其機制可分為兩類：模板選擇的差錯、斷裂重接中的差錯。質(zhì)粒的不穩(wěn)定性一般來源于其自身變化所造成的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，如質(zhì)粒DNA 的點突變、缺失突變、插入突變或重排。

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性通常發(fā)生在重組大腸桿菌的發(fā)酵過程中，這種由質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化引起結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性發(fā)生的頻率很低。因此，在生產(chǎn)中通常不考慮這種類型的不穩(wěn)定性。另外，具有重復(fù)基序的質(zhì)粒DNA 分子很容易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，這可能由缺失、插入［19］、重復(fù)、倒位和易位［20］等突變引起。還有一些因素也對其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性有影響，如（1）質(zhì)粒大小、polyA 序列、同向重復(fù)序列［3］、倒置重復(fù)序列和插入序列等也會影響質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。（2）環(huán)境壓力等相關(guān)因素，如抗生素濃度、培養(yǎng)基組分、溫度變化和氧含量的波動也會增加發(fā)生點突變的概率，或者促進整合基因間的或重復(fù)序列間［4］的重組。（3）由于大腸桿菌是可移動的、重組的DNA，如轉(zhuǎn)座子、插入序列元件和噬菌體相關(guān)基因的表達增加，也會引起質(zhì)粒DNA 的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，增加攜帶質(zhì)粒細胞的代謝負擔（即在大腸桿菌中表達重組質(zhì)粒DNA 時由質(zhì)粒的維持和復(fù)制以及培養(yǎng)條件造成的一些生物限制）。在這種情況下，質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，可看作是因攜帶質(zhì)粒的細胞中可移動的DNA 序列引起的突變，以及其他的遺傳變異體造成的結(jié)果。

1.2 大腸桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的消除

目前，消除質(zhì)粒在重組宿主內(nèi)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的方法主要有如下兩種：（1）從宿主基因組中除去大腸桿菌重組的、可移動的DNA 序列及其隱藏的毒力基因；（2）染色體整合法。2012 年，Sabido等［21］將來自源于豆根瘤菌的編碼酪氨酸合酶的melA 基因連接到新型表達載體pLoxGentrc 上，構(gòu)建成重組載體pLoxGentrcmelA（圖1），然后轉(zhuǎn)化入E. coli W3110 菌株中，成功構(gòu)建產(chǎn)黑色素的W3110/pLoxGentrcmelA 菌株，隨后以包含與lacZ 基因有45 b 同源的片段為引物，PCR 擴增質(zhì)粒pLoxGentrcmelA上包含PtrcmelA、T1 和T2 rrnB 末端序列及aacC1基因的區(qū)域，將擴增產(chǎn)物用電穿孔法導(dǎo)入產(chǎn)λ-Red酶的E. coli W3110 菌株中，構(gòu)建成melA 基因插入到lacZ 基因座的W3110PtrcmelA 菌株。和W3110/pLoxGentrcmelA 菌株相比，W3110PtrcmelA 菌株具有更高的遺傳穩(wěn)定性和黑色素表達量，其所使用的表達載體pLoxGentrc 具有更高的生長力，并且在無選擇壓力的情況下遺傳穩(wěn)定性更高，因而在外源蛋白表達菌株的構(gòu)建中將會是一種比較理想的載體。

2 分配不穩(wěn)定性

2.1 分配不穩(wěn)定性的產(chǎn)生

分配不穩(wěn)定性是指整個質(zhì)粒從細胞中丟失。在細胞分裂過程中，如果子細胞中的質(zhì)粒隨機分配，質(zhì)?？截悢?shù)就會發(fā)生波動，從而導(dǎo)致分配不穩(wěn)定性。

圖1 pLoxGentrcmelA 質(zhì)粒圖譜和將melA 基因整合入E.coli 染色體lacZ 基因座的策略

產(chǎn)生分配不穩(wěn)定性的因素主要包括以下幾個方面：（1）在發(fā)酵過程中，質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性和基因工程菌的代謝負擔相關(guān)。首先，在原核細胞中，轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是兩個競爭的過程。這意味著，轉(zhuǎn)錄的增加會阻斷細胞分裂時的質(zhì)粒分離，并超出了質(zhì)粒DNA 的修復(fù)能力。其次，由于需要維持質(zhì)粒并進行復(fù)制，宿主細胞會承擔額外的負擔，與不攜帶質(zhì)粒的細胞相比，其生長緩慢，這也是導(dǎo)致質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性的原因之一。（2）一個熟知的引起質(zhì)粒不穩(wěn)定性的原因是質(zhì)粒多聚體的積累，這會導(dǎo)致可分離的質(zhì)粒數(shù)目減少，使質(zhì)粒丟失的可能性增加。雖然同源重組不會經(jīng)常引起多聚體出現(xiàn)，但是它們會因過度復(fù)制而迅速積累，而且也會使那些僅含多聚體的細胞經(jīng)常變成無質(zhì)粒細胞。（3）質(zhì)粒DNA 的穩(wěn)定性也受培養(yǎng)條件，如溶解氧濃度和pH 值的影響。在生長培養(yǎng)基中，由于維持質(zhì)粒的穩(wěn)定需要足夠的溶解氧，溶解氧濃度水平的降低（低于閾值），會給質(zhì)粒修復(fù)帶來不利的影響［10，11］。此外，低pH 培養(yǎng)基會對細菌細胞造成壓力，導(dǎo)致高密度培養(yǎng)中質(zhì)粒的丟失。培養(yǎng)基的組成也可能會影響質(zhì)粒的分配型穩(wěn)定性；但是，有研究顯示，復(fù)合氮源如酵母提取物和胰蛋白胨的聯(lián)合使用不會降低質(zhì)粒的穩(wěn)定性［6］。有研究表明，這些復(fù)合氮源的使用能夠提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。由此可見，質(zhì)粒DNA 生產(chǎn)的發(fā)酵策略［8］對質(zhì)粒的穩(wěn)定性有至關(guān)重要的作用。（4）其他的因素，如抗生素抗性基因和質(zhì)?？截悢?shù)，也會影響質(zhì)粒的分配型穩(wěn)定性。在質(zhì)粒含有抗生素抗性基因同時存在選擇性壓力的情況下，具有卡那霉素抗性的質(zhì)粒比具有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒的菌株更穩(wěn)定。部分研究者認為，利用高拷貝質(zhì)粒會導(dǎo)致宿主菌株的代謝負擔增加，因細胞產(chǎn)量降低而導(dǎo)致質(zhì)粒DNA 的產(chǎn)量降低。

2.2 分配不穩(wěn)定性的消除

質(zhì)粒不穩(wěn)定性在長期操作中，尤其是連續(xù)培養(yǎng)時存在較嚴重的問題。針對質(zhì)粒的不穩(wěn)定性問題，解決的方法有抗生素選擇法，稀釋速率的動態(tài)循環(huán)法，兩階段連續(xù)培養(yǎng)法及λ 噬菌體的使用等。其中，人們希望λ 噬菌體系統(tǒng)能夠提供一種在溶原狀態(tài)下高度穩(wěn)定的克隆基因，而在溶原化狀態(tài)下該克隆基因產(chǎn)物能高效表達。2012 年，Jeong 等［23］基于Q—突變體構(gòu)建了3 種不同組合的λ 噬菌體載體λSNU1，λSNU2 和λSNU3，比較結(jié)果顯示，λSNU1 具有更高的蛋白表達量和遺傳穩(wěn)定性，在三者中為最好，這種噬菌突變體λSNU1 可用來提供一種高穩(wěn)定性和高生產(chǎn)力的克隆載體，尤其適用于長期持續(xù)的基因工程操作過程。

為了改善重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，已有研究者在探索一些相應(yīng)的策略［10，24-28］。選擇性壓力的存在及其類型，對保持或提高質(zhì)粒分配型穩(wěn)定性有重要的作用［29，30］。但是，由于抗生素抗性蛋白的生產(chǎn)導(dǎo)致的壓力，以及抗生素在生長培養(yǎng)基內(nèi)降解，通過增加生長培養(yǎng)基的選擇壓力，并不能改善質(zhì)粒的分配型穩(wěn)定性［10］。其他研究也證實，生長在選擇性環(huán)境下并沒有像預(yù)期那樣增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。然而，也有研究表明，經(jīng)誘導(dǎo)后，帶質(zhì)粒細胞在選擇壓力下比在非選擇性壓力下能維持更高的穩(wěn)定性。由于研究結(jié)果不一致，以及在特定情況下抗生素使用受到限制，目前，研究者已通過使用營養(yǎng)缺陷型的菌株，開發(fā)出了具有類似的或者更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性的非抗生素系統(tǒng)［24］，如阻遏滴定系統(tǒng)，必需生長基因表達的變換系統(tǒng)［25］，以及使用其他殺菌劑進行選擇的系統(tǒng)［26］。2008 年，Philip 等［27］構(gòu)建的pPSY 克隆載體來源于IncW 質(zhì)粒R388，能夠為穩(wěn)定克隆表型提供一種快速簡易的方法，插入的外源基因能夠保持穩(wěn)定而無需抗生素選擇，可用于在大腸桿菌中穩(wěn)定表達外源基因。2008 年，張剛等［31］將質(zhì)粒平均分配基因parDE 引入重組質(zhì)粒pDK7-fdh（攜帶甲酸脫氫酶基因fdh）中，得到基因重組菌F6，最后結(jié)果表明，引入parD 基因的基因重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性和甲酸脫氫酶活性均高于未引入parDE 基因的基因重組菌。2012 年，Nikel 等［28］構(gòu)建了一套用于將外源基因轉(zhuǎn)化入革蘭氏陰性菌染色體中的載體，并在大腸桿菌內(nèi)重建糖轉(zhuǎn)運和磷酸化的表達系統(tǒng)，這兩種表達系統(tǒng)由植入基因攜帶的信息在沒有任何選擇壓力的情況下能穩(wěn)定遺傳。此外，為了降低高拷貝質(zhì)粒所帶來的代謝負擔，可以在重組DNA 技術(shù)中替換使用低拷貝質(zhì)粒。與高拷貝的質(zhì)粒相比，在大腸桿菌中，這些低拷貝質(zhì)粒更加穩(wěn)定［32］，如pMB1 來源的質(zhì)粒，但可能會由于質(zhì)粒DNA 的量較低，而導(dǎo)致其產(chǎn)量也較低。

3 異構(gòu)不穩(wěn)定性

3.1 異構(gòu)不穩(wěn)定性的產(chǎn)生

在大腸桿菌中產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA 存在線性、開環(huán)和超螺旋幾種異構(gòu)體，因此，異構(gòu)穩(wěn)定性也是一個相關(guān)的特征，在應(yīng)用質(zhì)粒DNA 的生產(chǎn)過程中也要加以考慮。

超螺旋（supercoiled，SC）型質(zhì)粒，即特定的共價閉合環(huán)狀（Covalently closed circular，CCC）質(zhì)粒，與開環(huán)（Open circular，OC）或線性（Linear，L）質(zhì)粒相比，能夠在體外和體內(nèi)產(chǎn)生更高水平的基因表達［33，34］，因而質(zhì)粒的拓撲結(jié)構(gòu)顯得尤為重要。此外，將線性的亞型質(zhì)粒整合入宿主基因組中存在一個更大的風險，即會產(chǎn)生有害的影響。因此，在應(yīng)用于基因治療的質(zhì)粒生物藥劑學研究中，使用主要含有超螺旋型的質(zhì)粒DNA 是非?？扇〉?。

在大腸桿菌中，超螺旋化的程度由DNA 拓撲異構(gòu)酶和DNA 旋轉(zhuǎn)酶控制。已知，DNA 通過其超螺旋的改變，以應(yīng)對pH 值、滲透壓、營養(yǎng)供應(yīng)和饑餓以及缺氧等不同的環(huán)境條件。而且，在整個大腸桿菌發(fā)酵過程中，質(zhì)粒DNA 拓撲結(jié)構(gòu)都在發(fā)生變化，在對數(shù)生長期的大多數(shù)時間內(nèi)（多達10 h），超螺旋異構(gòu)體的百分比保持恒定［18］，進入平穩(wěn)期后，為應(yīng)對細菌對DNA 超螺旋的控制，質(zhì)粒超螺旋亞型的百分比減小。此外，在發(fā)酵過程結(jié)束時得到的質(zhì)粒超螺旋DNA 的百分比，受生長培養(yǎng)基和細菌菌株［35］不同的影響。

3.2 異構(gòu)體穩(wěn)定性的影響因素

研究表明，質(zhì)粒的異構(gòu)體穩(wěn)定性由許多因素決定，如質(zhì)粒負載、質(zhì)粒的拷貝數(shù)、復(fù)制模式、底物類型、培養(yǎng)基組分、宿主背景、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)溫度等。含有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，總是會帶來一系列的生理負擔，影響到質(zhì)粒的穩(wěn)定。當在大腸桿菌中表達制備的質(zhì)粒DNA 時，由質(zhì)粒的維持和復(fù)制以及培養(yǎng)條件造成的一些生物限制，負責限制最終的生物量和產(chǎn)物產(chǎn)量。這被稱為“代謝負擔”，它也可能對質(zhì)粒的穩(wěn)定性和質(zhì)量造成不利影響，因為細胞的機制不再能夠維持活躍的質(zhì)粒合成代謝，并且由質(zhì)粒維持引起的應(yīng)激反應(yīng)也會增加質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。從某種意義來說，質(zhì)粒的不穩(wěn)定性正是宿主細胞為克服或者消除這種代謝負擔而進行的自我保護。

3.3 影響異構(gòu)體穩(wěn)定性的“代謝負擔”的消除

在應(yīng)用大腸桿菌表達異源蛋白的過程中，質(zhì)粒的穩(wěn)定性是影響發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，丟失質(zhì)粒空細胞的出現(xiàn)會使目標蛋白產(chǎn)量下降。一般情況下，質(zhì)粒增加了細胞的代謝負擔，與含質(zhì)粒的細胞相比，丟失質(zhì)粒的空細胞通常具有較高的生長速率，若空細胞出現(xiàn)在發(fā)酵初期，將會成為優(yōu)勢群體。外源基因誘導(dǎo)表達后，由于代謝負擔的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性迅速降低。誘導(dǎo)型大腸桿菌表達系統(tǒng)的特點是，誘導(dǎo)后菌體進入生產(chǎn)階段，此時質(zhì)粒穩(wěn)定性已不再是影響生產(chǎn)的主要問題。由此可推斷，在使用大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達時，只要在發(fā)酵初期保持細胞不丟失質(zhì)粒，使其穩(wěn)定進入成長期，就可以避免所表達蛋白產(chǎn)量的下降。2012 年，Martí 等［36］提出了一種葡萄糖和IPTG 雙重限制策略，用于大腸桿菌的補料分批培養(yǎng)，以避免在誘導(dǎo)期發(fā)生新陳代謝失調(diào)。在保持葡萄糖生長限制的同時，降低IPTG 的濃度，乙酸的積累降低。IPTG 的濃度為0.03 mmol/g DCW 時，在誘導(dǎo)期沒有檢測到乙酸的積累，而在對照位置通常能檢測到。雖然采用這種雙重限制策略會使蛋白表達率略有下降，但是，由于誘導(dǎo)期的延長，達到了更高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從而提高了生物過程的單容積生產(chǎn)力。這個策略的另一個優(yōu)點是，由于使用的IPTG 更少，降低了培養(yǎng)基成本，同時也避免了乙酸積累對宿主細胞造成的代謝負擔。

與誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)相比，在組成型表達系統(tǒng)中，由于外源蛋白的持續(xù)表達，導(dǎo)致細胞代謝負擔加重，質(zhì)粒穩(wěn)定性的控制更加困難。通過優(yōu)化發(fā)酵策略，如升高或降低培養(yǎng)溫度、增大碳氮比可降低質(zhì)粒穩(wěn)定性；基本培養(yǎng)基可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性；不同的補料方式也影響到質(zhì)粒的穩(wěn)定性。2008 年，茍斌全等［22］通過對不同碳源、殘?zhí)菨舛鹊姆治?，?yōu)化了組成型大腸桿菌DH5α/pKKFPGA 補料發(fā)酵策略，增強了質(zhì)粒穩(wěn)定性，極大地提高了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；福ˋfPGA）的酶活單位。

4 小結(jié)

獲得高效表達外源基因的基因工程菌或細胞是基因工程的最終目的。經(jīng)過全面檢測的基因工程菌或細胞是實現(xiàn)重組基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)，使基因工程菌能夠保持相同的遺傳和生物學特征，在特定的培養(yǎng)環(huán)境和條件下持續(xù)穩(wěn)定表達攜帶的外源目的基因。檢定重組菌株遺傳穩(wěn)定性是為了確認經(jīng)過初步篩選的菌株符合預(yù)期設(shè)計要求，攜帶有穩(wěn)定的目的基因，能夠持續(xù)表達有功能活性的目的產(chǎn)物，滿足科研和生產(chǎn)的持續(xù)需求。重組菌的穩(wěn)定性受遺傳及環(huán)境因素的影響，其中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性是重組菌株傳代穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，對于生產(chǎn)及科研具有重要意義。

影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素是多方面的，各因素之間有很大的相關(guān)性，只改進其中一個方面往往不能取得明顯的效果，有時還存在一定的機遇性。但是，認識各因素的產(chǎn)生和作用機理，可以為提出改進方法提供理論依據(jù)。質(zhì)粒的穩(wěn)定性與質(zhì)粒的存在及其活動給宿主細胞帶來的生理負擔是限制重組基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)效果的主要矛盾，可以根據(jù)不同的科研和生產(chǎn)目的，在改良質(zhì)粒穩(wěn)定性和提高重組基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量之間做出相應(yīng)取舍，從而有針對性地構(gòu)建和改良外源基因表達系統(tǒng)，優(yōu)化基因工程菌的發(fā)酵策略，以實現(xiàn)最佳的科研和生產(chǎn)效益。

［1］ Ertl PF, Thomsen LL. Technical issues in construction of nucleic acid vaccines［J］. Methods, 2003, 31：199-206.

［2］ Ribeiro SC, Monteiro GA, Prazeres DM. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression［J］. J Gene Med, 2007, 9：392-402.

［3］ Hadj Kacem B, Gargouri J, Gargouri A. In vitro direct repeatsmediated deletion during PCR amplification［J］. Mol Biotechnol, 2008, 40：39-45.

［4］ Bi X, Liu LF. DNA rearrangement mediated by inverted repeats［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93：819-823.

［5］ Valesova R, Stepanek V, Vecerek B, Kyslik P. IS2-mediated rearrangement of the promoter sequence suppresses metabolic burden of the recombinant plasmid［J］. Folia Microbiol（Praha）, 2005, 50：275-282.

［6］ Oliveira PH, Prazeres DM, Monteiro GA. Deletion formation mutations in plasmid expression vectors are unfavored by runaway amplification conditions and differentially selected under kanamycin stress［J］. J Biotechnol, 2009, 143：231-238.

［7］ Haddadin FT, Harcum SW. Transcriptome profiles for high-celldensity recombinant and wild-type Escherichia coli［J］. Biotechnol Bioeng, 2005, 90：127-153.

［8］ Xu J, Li W, Wu J, et al. Stability of plasmid and expression of a recombinant gonadotropin-releasing hormone（GnRH）vaccine in Escherichia coli［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 73：780-788.

［9］ Summers DK, Sherratt DJ. Multimerization of high copy number plasmids causes instability：CoIE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability［J］. Cell, 1984, 36：1097-1103.

［10］ Goyal D, Sahni G, Sahoo DK. Enhanced production of recombinant streptokinase in Escherichia coli using fed-batch culture［J］. Bioresour Technol, 2009, 100：4468-4541.

［11］ Krishna Rao DV, Ramu CT, Rao JV, et al. Impact of dissolved oxygen concentration on some key parameters and production of rhG-CSF in batch fermentation［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35：991-1000.

［12］ Chen HC, Hwang CF, Mou DG. High-density Escherichia coli cultivation process for hyperexpression of recombinant porcine growth hormone［J］. Enzyme Microb Technol, 1992, 14：321-326.

［13］ O'Kennedy RD, Patching JW. Effects of medium composition and nutrient limitation on loss of the recombinant plasmid pLG669-z and beta-galactosidase expression by Saccharomyces cerevisiae［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 1997, 18：319-325.

［14］ O'Kennedy RD, Ward JM, Keshavarz-Moore E. Effects of fermentation strategy on the characteristics of plasmid DNA production［J］. Biotechnol Appl Biochem, 2003, 37：83-90.

［15］ Adamcik J, Viglasky V, Valle F, et al. Effect of bacteria growth temperature on the distribution of supercoiled DNA and its thermal stability［J］. Electrophoresis, 2002, 23：3300-3309.

［16］ Higgins CF, Dorman CJ, Stirling DA, et al. A physiological role for DNA supercoiling in the osmotic regulation of gene expression in S. typhimurium and E. coli［J］. Cell, 1988, 52：569-584.

［17］ O'Kennedy RD, Baldwin C, Keshavarz-Moore E. Effects of growth medium selection on plasmid DNA production and initial processing steps［J］. J Biotechnol, 2000, 76：175-183.

［18］ Freitas SS, Azzoni AR, Santos JA, et al. On the stability of plasmid DNA vectors during cell culture and purification［J］. Mol Biotechnol, 2007, 36：151-158.

［19］ Pristas P, Ivan J, Javorsky P. Structural instability of small rolling circle replication plasmids from Selenomonas ruminantium［J］. Plasmid, 2010, 64：74-81.

［20］ Oliveira PH, Prather KJ, Prazeres DM, Monteiro GA. Structural instability of plasmid biopharmaceuticals ：challenges and implications［J］. Trends Biotechnol, 2009, 27：503-513.

［21］ Sabido A, Martínez LM, de Anda R, et al. A novel plasmid vector designed for chromosomal gene integration and expression：Use for developing a genetically stable Escherichia coli melanin production strain ［J］. Plasmid, 2012, 69：16-23.

［22］ 茍斌全, 張嗣良, 儲炬, 等. 增強組成型重組大腸桿菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的發(fā)酵策略［J］. 化學與生物工程, 2008, 25（10）：23-26.

［23］ Jeong SO, Shin SC, Jong-Kee Y, et al. Construction of various bacteriophage λ mutants for stable and efficient production of recombinant protein in Escherichia coli［J］. Process Biochemistry, 2007, 42 ：486-490.

［24］ Vidal L, Pinsach J, Striedner G, et al. Development of an antibioticfree plasmid selection system based on glycine auxotrophy for recombinant protein overproduction in Escherichia coli［J］. J Biotechnol, 2008, 134：127-162.

［25］ Mairhofer J, Pfaffenzeller I, Merz D, Grabherr R. A novel antibiotic free plasmid selection system：advances in safe and efficient DNA therapy［J］. Biotechnol J, 2008, 3：83-91.

［26］ Goh S, Good L. Plasmid selection in Escherichia coli using an endogenous essential gene marker［J］. BMC Biotechnol, 2008, 8：61-69.

［27］ Philip DS, Sarovich DS, Pemberton JM. pPSY：A vector for the stable cloning and expression of streptomycete single gene phenotypes in Escherichia coli［J］ . Plasmid, 2008, 60 ：53-58.

［28］ Nikel PI, de Lorenzo V. Implantation of unmarked regulatory and metabolic modules in Gram-negative bacteria with specialised minitransposon delivery vectors［J］. J Biotechnol, 2013, 163 ：143-154.

［29］ 陸文淵, 成浩, 王麗鴛, 周健. 茶氨酸生物合成基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性研究［J］. 茶葉科學, 2008, 28（2）：147-151.

［30］ 王宏華, 凌紅麗, 侯竹美, 等. 雞γ-干擾素基因重組質(zhì)粒在工程菌株中的穩(wěn)定性研究［J］. 微生物學通報, 2008, 35（7）：1055-1058.

［31］ 張剛, 楊光, 裴海生, 等. 質(zhì)粒平均分配基因parDE 甲酸脫氫酶NADH 再生系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響［J］. 過程工程學報, 2008, 8（2）：345-349.

［32］ Filomena S, Jo?o AQ, Fernanda CD. Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli［J］. Biotechnol Adv, 2012, 30 ：691-708.

［33］ Sousa F, Prazeres DM, Queiroz JA. Improvement of transfection efficiency by using supercoiled plasmid DNA purified with arginine affinity chromatography［J］. J Gene Med, 2009, 11：79-88.

［34］ Thumann G, Stocker M, Maltusch C, et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor［J］. Gene Ther, 2010, 17：181-189.

［35］ Yau SY, Keshavarz-Moore E, Ward J. Host strain influences on supercoiled plasmid DNA production in Escherichia coli：implications for efficient design of large-scale processes［J］. Biotechnol Bioeng, 2008, 101：529-572.

［36］ Martí L, Enric S, Antoni C, et al. IPTG limitation avoids metabolic burden and acetic acid accumulation in induced fed-batch cultures of Escherichia coli M15 under glucose limiting conditions［J］. Biochem Eng J, 2013, 70：78-83.