洪亞輝，謝偉國，程鵬，李俊

利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的好食脈孢菌選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化

洪亞輝1,2，謝偉國1,2，程鵬1,2，李俊1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128）

通過高壓富集法，從土壤中分離篩選得到一株纖維素降解菌株，并對其木糖發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究。根據(jù)菌株的形態(tài)特性和生理生化特征，初步鑒定為好食脈孢菌（Neurospora sitophila）。結(jié)果表明，該菌株CMC酶活力為3 554.88 U·g-1、FPA酶活力為506.76 U·g-1，當(dāng)紫外線照射劑量30 W，照射距離20 cm，照射時(shí)間為8 min時(shí)，致死率為77.28%。在木糖濃度20 g·L-1、發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、轉(zhuǎn)速140 r·min-1的條件下乙醇產(chǎn)量可達(dá)5.5 g·L-1，乙醇得率為理論值的59.8%。

好食脈孢菌；木糖；發(fā)酵；乙醇；紫外誘變

纖維素主要由半纖維素、木質(zhì)素組成[1]。在半纖維素被降解后，其水解產(chǎn)物中絕大部分是木糖[2]。木糖是除了葡萄糖之外的單糖，因此，篩選良好的發(fā)酵菌株是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)纖維素乙醇的最重要因素。而脈孢菌（Neurospora）同時(shí)具有產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和發(fā)酵乙醇所需酶能力，能直接轉(zhuǎn)化纖維素為乙醇[3-4]。本研究旨在尋找新的高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇野生脈孢菌株，通過分子生物學(xué)技術(shù)等手段對一株從土壤中分離篩選出的纖維素降解菌株進(jìn)行菌種種類鑒定，并對其生長特性與發(fā)酵特性進(jìn)行深入研究，找到最佳發(fā)酵條件或適宜突變菌株，為木糖利用關(guān)鍵技術(shù)研究提供優(yōu)良菌株資源。

1 材料和方法

1.1 菌株

從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊農(nóng)田采集土樣分離菌株。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

木糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基[5]：木糖：20 g；蛋白胨：15 g；酵母粉：10 g；NH4SO4：1 g；KH2PO4：1 g；MgSO4·7H2O：0.5 g；CaCl2·2H2O：1 g，H2O：1 000 mL。

纖維素瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂18g，纖維素20g，蛋白胨：15 g；酵母粉：10 g；NH4SO4：1 g；KH2PO4：1 g；MgSO4·7H2O：0.5 g；CaCl2·2H2O：1 g，H2O： 1 000 mL。

纖維素產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KH2PO4：1 g，F(xiàn)eCl3：0.01 g，MgSO4·7H2O：0.3 g，NaNO3：2.5 g，CaCl2：0.1 g，NaCl：0.1 g，H2O：1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 發(fā)酵木糖菌株的篩選

稱取適量已干燥土壤于5 mL滅菌去離子水中制成菌懸液，混勻后取1～9 mL無菌水中，從稀釋十倍的菌懸液中取1～9 mL無菌水中再稀釋十倍，將菌懸液稀釋至10-5，再用纖維素瓊脂培養(yǎng)基在30℃恒溫條件下篩選，將篩選菌株統(tǒng)一編號。在30℃、120 r·min-1條件下，搖瓶發(fā)酵48 h，篩選乙醇得率較高菌株。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)特征

挑取少量篩選的菌體，涂布在PDA培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，主要包括菌落的形狀、顏色、濕潤情況、隆起形狀、邊緣整齊情況等方面。菌落的個(gè)體形態(tài)特征在JSM-6380LV掃描電子顯微鏡下觀察[6]。

1.4.2 菌株的生理生化特征

碳源同化：選用硫酸銨作為氮源，測試其碳源的同化能力，包括Galactose、Sucrose、Ethanol、Sorbose、Citric acid、Mannitol。糖發(fā)酵：選用硫酸銨—氮源，測試其糖類的發(fā)酵能力，包括Soluble starch、Glucose、Sucrose、Lactose、Xylose。氮源同化：選用葡萄糖—碳源，測試其碳源的同化能力，包括Potassium nitra、Ammonium sulfate。以上3組試驗(yàn)都在120 r·min-1、30℃下恒溫培養(yǎng)。

1.4.3 分子鑒定

用SDS法提取目的菌株的總DNA后，采用ITS通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃3 min；94℃1 min，54℃45 s，72℃45 s，35 Cycles；72℃10 min。4℃保存。測序得到的ITS序列利用Clustal X、MEGA4.1等第三方軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。結(jié)合形態(tài)生理生化特征的檢測結(jié)果以及ITS分析確定所得菌株的種屬關(guān)系。

1.4.4 濾紙酶活力（FPA）與羥甲基纖維素酶活力（CMCA-DNS）的測定

纖維素酶在一定溫度和pH條件下，將纖維素底物（濾紙或CMC-Na）水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，3，5-二硝基水楊酸（DNS試劑）與還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色深淺與還原糖（葡萄糖）含量成正比。通過在540 nm測其吸光度，可得到產(chǎn)生還原糖量，計(jì)算出纖維素酶的濾紙酶活力。

①粗酶液的制備

取培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，于4℃、3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，即為粗酶液。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與濾紙酶活力（FPA）測定

定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（IU），其計(jì)算公式為：

式中，X1-樣品的濾紙酶活力（FPA），（U·g-1或 U·mL-1）；X2-羥甲基纖維素酶活力（CMCA-DNS），（U·g-1或U·mL-1）；A-根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上差得（或計(jì)算出）還原糖量（mg）；1/0.5-換算成酶液1 mL；n-酶樣的稀釋倍數(shù)；2-時(shí)間換算系數(shù)。

1.5 菌株的紫外誘變與篩選

將用生理鹽水制備好的孢子懸液放置于30 W紫外燈下距離20 cm處進(jìn)行誘變，誘變時(shí)間跨度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min。到達(dá)照射時(shí)間后，用移液槍吸取0.1 mL并稀釋涂平板，每個(gè)照射時(shí)間依次稀釋到104·mL-1、103·mL-1、102·mL-1，每個(gè)梯度吸取0.1 mL涂在纖維素瓊脂平板上，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行試驗(yàn)組，計(jì)數(shù)時(shí)取兩者的平均數(shù)。在避光，29℃條件下倒置培養(yǎng)。1～2 d后挑取長勢較好的單菌落接斜面培養(yǎng)，用于進(jìn)一步篩選。

1.6 菌株發(fā)酵木糖工藝條件優(yōu)化

1.6.1 菌株生長曲線的繪制

在30℃、120 r·min-1的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h，每隔4 h取一次樣品，測定乙醇濃度、殘?zhí)菨舛燃捌渚w的干重，構(gòu)建篩選菌株的生長曲線。

1.6.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)中設(shè)置不同的木糖濃度（10、15、20、25、30 g·L-1），不同的發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45℃），不同的發(fā)酵時(shí)間（24、48、72、96、120 h），不同的搖床轉(zhuǎn)速（100、120、140、160、180 r·min-1）。根據(jù)摸索得到最合適的木糖濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速來設(shè)計(jì)影響因子的水平，采用四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)（見表1），以乙醇的濃度為考察指標(biāo)，確定發(fā)酵最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Table of orthogonal experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵木糖菌株篩選與濾紙酶活力（FPA）測定

根據(jù)纖維素瓊脂培養(yǎng)基表面上纖維素水解透明圈大小及其相應(yīng)菌株的木糖利用率和乙醇產(chǎn)率，篩選到5株產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的菌株，將其分別編號為X1、X2、X3、X4、X5。

由表2可知，X4號菌株的乙醇產(chǎn)量和乙醇得率最高，發(fā)酵20 g·L-1木糖產(chǎn)乙醇含量為5.05 g·L-1，乙醇得率接近理論值的54.89%，并命名X4菌株為YYH101。YYH101經(jīng)過濾紙酶活力測定，其CMC酶活力3 554.88 U·g-1、FPA酶活力506.76 U·g-1，且其活力穩(wěn)定性好。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征鑒定

菌株YYH101首先呈白色透明樹狀匍匐菌絲，待氣生菌絲長出來后，呈白色絨毛狀見圖1。菌絲表現(xiàn)為匍匐生長趨勢，菌落透明且多橫隔[7]。最終氣生菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色分生孢子，分子孢子多為卵圓形，成熟后多以團(tuán)塊形式聚集，掃描電子顯微鏡下可見孢子表面有皺?。ㄒ妶D2）。

2.2.2 菌株的生理生化特征鑒定

篩選菌株YYH101的生理生化同化試驗(yàn)結(jié)果詳見表3。

對照參考文獻(xiàn)[8]生理生化特征，判斷菌株YYH101為脈孢菌屬（Neurospora）。

表2 菌株篩選的發(fā)酵試驗(yàn)Table 2 Fermentation test filter of strains

圖1 菌株YYH101的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain YYH101

圖2 菌株YYH101的掃描電鏡Fig.2 Strian YYH101 under scanning electron microscope

表3 菌株YYH101的生理生化同化試驗(yàn)Table 3 The test of physiological and biochemical assimilation of strain YYH101

2.2.3 分子鑒定

測定篩選菌株YYH101的ITS全長序列，全長為559 bp。該菌株的ITS序列結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列同源性分析，比對結(jié)果得知篩選菌株YYH101的ITS序列與登錄號為JF911746.1（Neurospora sitophilaQH9）的菌株的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%。因此，初步判定菌株YYH101為好食脈孢菌（Neurospora sitophila）。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree

2.4 菌株的紫外誘變與篩選

由表4和圖4可見，在誘變前6 min內(nèi)時(shí)，致死率不明顯；6 min時(shí)致死率達(dá)到50.75%，6 min后致死率隨紫外線照射時(shí)間延長，孢子死亡率逐漸提高，在8 min時(shí)致死率達(dá)到77.28%，在9和10 min時(shí)，菌體死亡率分別達(dá)到85.61%和91.67%，致死效果十分顯著。因此，在紫外線照射劑量30 W，照射距離20 cm，照射時(shí)間為8 min時(shí)，其菌株YYH13正突變率最高。

表4 紫外處理對菌種的致死率Table 4 Fatality rate after ultraviolet radiation

圖4 紫外處理對菌種的致死率Fig.4 Fatality rate after ultraviolet radiation

2.3 菌株發(fā)酵木糖最適條件優(yōu)化

2.3.1 菌株的生長曲線

從圖5可見，YYH101在48～68 h生長速度較快，處于對數(shù)生長期；68 h后由于細(xì)胞自溶、底物或溶氧的減少生長速度開始下降，菌體逐步減少并進(jìn)入衰退期。因此，本研究以最適菌體生長時(shí)期進(jìn)行培養(yǎng)，菌種活化培養(yǎng)的時(shí)間為60～68 h。

2.3.2 木糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響

從本試驗(yàn)結(jié)果得出，隨木糖濃度增加，細(xì)胞生長速率逐漸降低，但最終生物量累積并無過大差異。不同木糖濃度下細(xì)胞生長呈各方面相似趨勢，高濃度木糖條件不存在對細(xì)胞生長的抑制作用。初步認(rèn)為在10～20 g·L-1條件下木糖可以被全部利用，在20 g·L-1時(shí)乙醇產(chǎn)量最高，為3.25 g·L-1，乙醇得率為35.32%，其余濃度條件下木糖利用率不高，且木糖濃度越高，其利用率越低。乙醇產(chǎn)量因初始木糖濃度不同而不同，乙醇生成速率隨初始木糖濃度升高而降低（如圖6）。

圖6 木糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of concentration of xylose on ethanol yield

2.3.3 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響

從本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株YYH101在不同發(fā)酵溫度條件下產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量不同。當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)2.75 g·L-1，乙醇得率接近理論值的29.89%；當(dāng)發(fā)酵溫度在25至35℃時(shí)，發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量影響較小；當(dāng)發(fā)酵溫度超過35℃，菌體的發(fā)酵產(chǎn)乙醇的含量減少15%，初步認(rèn)為25～35℃為發(fā)酵溫度的篩選區(qū)間。見圖7。

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對乙醇產(chǎn)量的影響

從本試驗(yàn)結(jié)果得出，菌株YYH101在不同發(fā)酵時(shí)間條件下產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量不同。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48～96 h時(shí)，本試驗(yàn)菌株都能被木糖利用發(fā)酵產(chǎn)乙醇。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇濃度較高，乙醇產(chǎn)量為3.22 g·L-1，乙醇得率為35.4%。因此，初步認(rèn)為48～96 h為適宜發(fā)酵時(shí)間（見圖8）。

2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對乙醇產(chǎn)量的影響

當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時(shí)，乙醇產(chǎn)量5.12 g·L-1達(dá)到最高，乙醇得率為理論值的55.6%。當(dāng)轉(zhuǎn)速小于120 r·min-1時(shí)，因菌體基數(shù)過小而影響菌體的生長總量，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量明顯降低；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于160 r·min-1時(shí)，因菌體基數(shù)過大而影響菌體的生長總量，也導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量明顯降低，因此，初步認(rèn)為120～160 r·min-1為適宜轉(zhuǎn)速（見圖9）。

圖7 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on ethanol yield

圖8 發(fā)酵時(shí)間對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of time on ethanol yield

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of rotate speed on ethanol yield

2.3.6 發(fā)酵的最佳條件

由表5可知，R值的大小分別為A>D>B>C，對乙醇生成產(chǎn)生影響因素從主到次依次為木糖濃度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。各因子最佳組合是A3B1C3D2，因此，最佳發(fā)酵條件為：木糖濃度20 g·L-1，溫度25℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，乙醇產(chǎn)量達(dá)5.5 g·L-1，乙醇得率為理論值59.8%。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test

3 討論與結(jié)論

本研究篩選出一株產(chǎn)乙醇的菌株，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對菌株進(jìn)行鑒定，初步確定為好食脈孢菌。脈孢菌屬的酶系豐富，作為絲狀真菌既能轉(zhuǎn)化纖維素、半纖維素、淀粉類等物質(zhì)產(chǎn)生乙醇，又能同時(shí)利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)乙酵，為實(shí)現(xiàn)一步法的發(fā)酵工藝提供理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果將為研究好食脈孢菌產(chǎn)乙醇機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)還可以利用該優(yōu)良菌株研究混菌發(fā)酵制備高催化活性的纖維素酶，鑒于其較高的纖維素酶活力，也能將其利用于混合底物的乙醇發(fā)酵，為生物再生能源的開發(fā)應(yīng)用和科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

通過高壓富集法從土壤中初步分離篩選得到5株纖維素降解菌株，再以木糖作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，得到一株高效代謝木糖產(chǎn)乙醇的菌株，初步鑒定為好食脈孢菌（Neurospora sitophila）。該菌株CMC酶活力為3 554.88 U·g-1、FPA酶活力為506.76 U·g-1，且在紫外燈（30 W，20 cm）下，照射時(shí)間8min時(shí)，致死率為77.28%，在木糖濃度20 g·L-1、發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、轉(zhuǎn)速140 r·min-1的條件下乙醇產(chǎn)量達(dá)5.5 g·L-1，乙醇得率為理論值的59.8%。

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Breeding ofNeurospora sitophilato produce ethanol from xylose and optimization of fermentation conditions

HONG Yahui1,2,XIE Weiguo1,2,CHENG Peng1,2,LI Jun1,2
(1.School of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Using the high pressure enrichment method,one bacteria strian were separated from soil,which can identified as cellulose degradation strains,and the xylose fermentation characteristics were studied.According to the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of strains this strian was initially identified as Neurospora sitophila.The strain of CMC enzyme activity of 3 554.88 U·g-1,FPA enzyme activity of 506.76 U·g-1,when ultraviolet irradiation dose 30 W,20 cm distance,the irradiation time of 8 min,the fatality rate was 77.28%.The xylose concentration 20 g·L-1,25℃fermentation temperature,fermentation time 96 h,under speed 140 rmp of ethanol production could reach 5.5 g·L-1,the ethanol yield for 59.8%of the theoretical value.

Neurospora sitophila;Xylose;fermentation;ethanol;ultraviolet mutagenesis

S646.9

A

1005-9369（2014）01-0070-07

2013-07-22

國家973計(jì)劃課題（2012CB723004）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目（12C0164）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金（11QN11）；作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放項(xiàng)目（11KFXM09）

洪亞輝（1955-），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail:yahuihong@vip.sina.com

時(shí)間2014-1-9 19:31:27[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.1931.003.html

洪亞輝,謝偉國,程鵬,等.利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的好食脈孢菌選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1):70-76.

Hong Yahui,Xie Weiguo,Cheng Peng,et al.Breeding ofNeurospora sitophilato produce ethanol from xylose and optimiza

tion of fermentation conditions[J].Journal of Northeast Agricultural University,2013,44(1):70-76.(in Chinese with English

abstract)