付連雙，王曉楠，李卓夫，謝冬微，孫瑩璐，鄭偉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯 154007）

不同土壤水分處理下冬小麥細胞活力差異比較

付連雙1，王曉楠1，李卓夫1，謝冬微1，孫瑩璐1，鄭偉2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯 154007）

采用抗寒性不同的兩個冬小麥品種“東農(nóng)冬麥1號”和“濟麥22”為試驗材料，設(shè)置土壤絕對含水量15%±2%、30%±2%、45%±2%和對照（CK，35%～40%）4個水分處理，對越冬期間低溫與水分雙重脅迫下細胞的活力變化進行研究。結(jié)果表明，兩品種葉片、葉鞘細胞活力隨取樣日期變化有降低趨勢；兩品種間比較，進入封凍期20 d以后細胞活力差異明顯，細胞失活受損程度上表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號輕于濟麥22；在不同土壤水分條件下，CK處理下（正常水分管理）細胞活力最佳；取樣部位上，葉鞘細胞活力好于葉片。

土壤含水量；細胞活力；冬小麥

黑龍江省地處高寒地區(qū)，“九五”期間，曾進行過冬麥北移試驗，但因品種適應(yīng)性問題并未取得成功，品種抗寒性是限制寒地冬小麥種植的首要問題。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)于2007年育成適應(yīng)高寒地區(qū)生長的第一個冬小麥品種“東農(nóng)冬麥1號”，其推廣應(yīng)用對于增加黑龍江省糧食產(chǎn)量，改善作物布局，促進各作物協(xié)調(diào)增產(chǎn)具有重要意義[1]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥課題組在寒地冬小麥越冬領(lǐng)域的研究結(jié)果表明，返青期低溫脅迫會導(dǎo)致冬小麥幼苗葉鞘MDA含量增加，其值與返青率呈顯著負相關(guān)[2]；細胞超微結(jié)構(gòu)觀察表明，封凍后30 d抗寒性強品種分蘗節(jié)細胞只發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，細胞核依然完整，抗寒性弱品種細胞中內(nèi)含物消失，細胞空泡化[3]；播期過早或過晚均會加重低溫對不同冬小麥品種的膜傷害，以播種期到封凍期積累500～600℃有效積溫為適宜播期[4]；播種深度4～6 cm更有利于冬小麥越冬成活[5]。這些研究對指導(dǎo)黑龍江省冬小麥安全越冬具有重要理論和實踐意義。土壤水分也是影響冬小麥能否安全越冬的另一個重要因素，本文采用水分梯度試驗，對不同土壤水分處理下冬小麥返青率和電導(dǎo)率變化進行研究，結(jié)果表明，入冬前土壤絕對含水量為35%～40%時，更有利于冬小麥安全越冬[6]。在冬小麥越冬過程中，植株能否安全越冬又是一個由量變到質(zhì)變的過程，取決于植株細胞受傷害程度，觀察越冬期間冬小麥植株細胞活力，能夠真實反映植株細胞的存活情況。中性紅染色法是常用來進行細胞活力檢測的有效方法，將中性紅染色法用在抗寒性鑒定上，可鑒別不同品種植株細胞在低溫脅迫下的致死情況，具有簡便快速的特點。本文針對越冬期間不同土壤水分處理下植株細胞活力進行分析，旨在探究水分對冬小麥細胞活力的影響，以期進一步明確土壤含水量對寒地冬小麥越冬性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計

以抗寒性不同的兩個冬小麥品種“東農(nóng)冬麥1號”（DN1）和“濟麥22”（JM22）為試驗材料，采用3個土壤含水量梯度處理（土壤絕對含水量的15%± 2%、30%±2%和45%±2%）和一個對照（CK）處理（正常水分管理）。水分梯度試驗在抗旱防雨棚中進行，自出苗后每3 d測定1次含水量，直至封凍。對照（CK）組正常管理，根據(jù)土壤干濕狀況等量供水，保持土壤濕潤，封凍前測定其土壤絕對含水量為35.2%～40.1%。

采用盆栽試驗，隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，盆栽試驗中盆規(guī)格為直徑300 mm，高275 mm，供試土壤為黑土，每盆裝干土12 kg。試驗地點在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽試驗場，于2009年9月中旬播種，10月初定苗，每盆保苗30株，10月下旬開始取樣，每3周取樣1次，共取樣6次。試驗期間溫度變化見圖1（氣象數(shù)據(jù)來源于黑龍江省氣象臺），各取樣期氣溫變化如下：2009年10月21日（0～8℃）、2009年11月11日（-13～-3℃）、2009年12月2日（-21～-10℃）、2009年12月26日（-26～-16℃）、2010年1月14日（-28～-17℃）和2010年2月4日（-23～-16℃）。

圖1 試驗期內(nèi)日最高氣溫、最低氣溫與平均氣溫Fig.1 Maximum，minimum and average temperatures per day during sampling period

1.2 測試項目及方法

每次每個處理隨機取樣10株，并各取其第三片葉及葉鞘進行細胞活力觀察。植株細胞活力檢測采用中性紅活體染色法[7]，光學(xué)顯微鏡（NIKON801+DM×1200C）下等倍放大觀察并拍照。鏡檢中呈現(xiàn)紅色的細胞為有活力細胞，不被染色呈無色的為死細胞。每個處理選取3個視野，將各處理中典型有代表性的照片進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片不同取樣日期及不同品種間的細胞活力分析

15%±2%水分處理葉片細胞活力檢測結(jié)果見圖版I。在15%±2%水分處理組，東農(nóng)冬麥1號10月21日（見圖版I-1）葉片死細胞比例較少，11月11日（見圖版I-2）、12月2日（見圖版I-3）死細胞比例增大，細胞活力減小，至12月26日（見圖版I-4），所有細胞均失去活力。濟麥22葉片，從10月21日（見圖版I-7）至11月11日（見圖版I-8）被染色的細胞數(shù)量逐漸減少，死細胞比例逐漸增加，至12月2日（見圖版I-9）時所有細胞均未被染色，細胞全部死亡。

品種間相比，10月21日和11月11日差異較??；12月2日差異明顯，東農(nóng)冬麥1號葉片仍有部分細胞存在活力；12月26日以后兩品種葉片細胞均全部失活。

圖版I15%±2%水分處理葉片細胞活力變化Plate IChanges of leaves cell viability under water content 15%±2%treatment

30%±2%水分處理葉片（見圖版II），東農(nóng)冬麥1號品種10月21日（見圖版II-1）、11月11日（見圖版II-2）細胞活力無差異，都表現(xiàn)為少部分細胞失活，到12月2日（見圖版II-3），有活力細胞只占很小比例，至12月26日（見圖版II-4），細胞全部失活。濟麥22在10月21日（見圖版II-7）和11月11日（見圖版II-8）細胞活力較好，到12月2日（見圖版II-9）則全部失活。品種間比較，10月21日至12月2日東農(nóng)冬麥1號細胞活力較好，12月26日以后則無差異。

圖版II30%±2%水分處理葉片細胞活力變化Plate IIChanges of leaves cell viability under water content 30%±2%treatment

45%±2%水分處理葉片（見圖版III），東農(nóng)冬麥1號從10月21日至12月2日（見圖版III-1、III-2、III-3），隨取樣日期推遲，細胞活力逐漸減小，到12月26日（見圖版III-4）所有細胞均死亡。濟麥22品種10月21日（見圖版III-7）失活較少，11月11日（見圖版III-8）失活較重，到12月2日（見圖版III-9）則全部失活。

品種間相比，從10月21日至12月2日，東農(nóng)冬麥1號細胞活力好于濟麥22，12月26日以后則無活力。

正常管理（CK）條件下葉片（見圖版IV），東農(nóng)冬麥1號細胞活力隨取樣時間推移（見圖版IV-1～6），死細胞比例逐漸增多。

濟麥22在10月21日（見圖版IV-7）和11月11日（見圖版IV-8）細胞活力較高，12月2日（見圖版IV-9）活力明顯變小。品種間，10月21日、11月11日相比，細胞受傷害程度接近，從12月2日開始細胞活力出現(xiàn)較大差異，表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號細胞活力要好于濟麥22。東農(nóng)冬麥1號葉片在所有6期取樣中都有活細胞被檢測到，而濟麥22從12月26日至2月4日（見圖版IV-10～12）則無活細胞存在。

圖版III45%±2%水分處理葉片細胞活力變化Plate IIIChanges of leaves cell viability under water content 45%±2%treatment

2.2 葉鞘不同取樣日期及不同品種間細胞活力分析

15%±2%水分處理葉鞘（見圖版V），東農(nóng)冬麥1號葉鞘細胞活力在10月21日至12月2日（圖版V-1～3）差異明顯，死細胞比例隨取樣日期變化逐漸增多；12月26日至2月4日（見圖版V-4～6），活細胞均所剩無幾，彼此間差異較小。濟麥22品種在10月21日（見圖版V-7）取樣時細胞失活較少，11月11日（見圖版V-8）取樣時細胞失活比例明顯增加，至12月2日（見圖版V-9）則無活細胞存在。兩品種間相比較，在不同取樣時期，東農(nóng)冬麥1號細胞活力都好于濟麥22。

圖版IVCK水分處理葉片細胞活力變化Plate IVChanges of leaves cell viability under water content control treatment

30%±2%水分處理葉鞘（見圖版VI），東農(nóng)冬麥1號細胞活力隨取樣日期變化逐漸降低，10月21日（見圖版VI-1）和11月11日（見圖版VI-2）細胞活力差異不明顯，12月2日（見圖版VI-3）取樣與11月11日差異明顯，12月26日以后（見圖版VI-4～6）細胞活力均較小。濟麥22從10月21日至12月 26日（見圖版VI-7～10）活力差異明顯，活細胞比例逐漸減小，至1月14日之后（見圖版VI-11～12）所有細胞均失去活力。品種間比較，在各取樣期，東農(nóng)冬麥1號細胞活力均好于濟麥22。

45%±2%水分處理葉鞘（見圖版VII），東農(nóng)冬麥1號葉鞘細胞10月21日至12月2日（見圖版VII-1～3）細胞活力差異較大，細胞活力逐漸減小，12月26日（見圖版VII-4）與12月2日活力接近，1月14日（見圖版VII-5）、2月4日（見圖版VII-6）活力嚴重降低。濟麥22在10月21日（見圖版VII-7）和11月11日（見圖版VII-8）相比活力差異不明顯，活力均較高，至12月2日（見圖版VII-9），細胞活力明顯變小。

品種間相比較，濟麥22品種葉鞘細胞只在前三期取樣中存在活力，而東農(nóng)冬麥1號在全部六期取樣中均有活細胞存在。

圖版V 15%±2%水分處理葉鞘細胞活力變化Plate V Changes of Leaf sheath cell viability under water content 15%±2%treatment

CK處理葉鞘（見圖版VIII），東農(nóng)冬麥1號10月21日至12月26日（見圖版VIII-1～4）細胞活力差異明顯，細胞活力逐漸減小，至1月14日以后（見圖版VIII-5～6）仍有少部分細胞存在活力。濟麥22從10月21日至12月2日（見圖版VIII-7～9）細胞活力明顯變小，12月26日（見圖版VIII-10）與12月2日（見圖版VIII-9）活力差異較小，1月14日以后（見圖版VIII-11、VIII-12）則無活細胞出現(xiàn)。品種間，10月21日兩品種細胞活力均較高，11月11日和12月2日東農(nóng)冬麥1號細胞活力大于濟麥22，12月26日品種間差異不明顯，1月14日以后東農(nóng)冬麥1號好于濟麥22。

圖版VI 30%±2%水分處理葉鞘細胞活力變化Plate VI Changes of Leaf sheath cell viability under water content 30%±2%treatment

2.3 同一品種、同一部位土壤水分間細胞活力分析

東農(nóng)冬麥1號葉片，在所有4個水分處理下，10月21日、11月11日，細胞活力受水分影響較小，均表現(xiàn)為少部分細胞失活。12月2日開始，CK管理條件下細胞活力要好于另外3個土壤水分處理，12月26日至1月14日，在CK處理條件下仍有一小部分有活力細胞存在，而另外3個水分處理中則全部失活。封凍期以后土壤水分虧缺（15%± 2%、30%±2%）和水分過多（45%±2%）都會影響東農(nóng)冬麥1號葉片細胞活力。

濟麥22葉片，10月21日取樣的4個水分處理中，均有很少一部分細胞死亡；11月11日取樣，15%±2%和45%±2%水分處理失活最多，30%±2%處理次之，而CK處理下失活最少。從12月26日開始，不同土壤水分處理下，均未檢測到有活力細胞存在。

東農(nóng)冬麥1號葉鞘，在10月21日的4個水分處理中，細胞活力無明顯差異，都表現(xiàn)為小部分細胞失活。11月11日，15%±2%和45%±2%水分處理下葉鞘細胞失活較重，而30%±2%和CK兩個處理死細胞相對較少。至12月2日CK水分處理下活細胞比重要高于其他處理。從12月26日取樣開始，其活力在水分處理間差異不明顯，都表現(xiàn)為失活嚴重。

圖版VII 45%±2%水分處理葉鞘細胞活力變化Plate VII Changes of Leaf sheath cell viability under water content 45%±2%treatment

濟麥22葉鞘，10月21日至12月2日，15%± 2%土壤水分處理下細胞活力最低，而其他3個處理細胞活力差異不明顯。12月26日取樣，30%± 2%和CK兩個處理均有少量有活力細胞存在，而另兩個處理細胞全部失活。1月14日和2月4日，所有水分處理下的細胞均全部失活。

圖版VIII CK水分處理葉鞘細胞活力變化Plate VIII Changes of Leaf sheath cell viability under water content control treatment

3 討論與結(jié)論

3.1 試驗品種及取樣部位對細胞活力的影響

在pH為中性時，中性紅染料能夠進入活細胞和死細胞中，在活體細胞中中性紅染料易解離并存留在其內(nèi)部，經(jīng)清水漂洗后不溢出而使細胞染成紅色，而在死細胞中不易解離，經(jīng)漂洗后染料較容易溢出，不能使細胞染色[8]。本試驗中東農(nóng)冬麥1號葉鞘從10月21日（日平均溫度：4℃）至第二年2月 4日（日平均溫度：-19.5℃）的4個土壤水分處理下都能檢測到有活力細胞，而葉片則只在CK條件下各取樣時期檢測到有活力細胞，而在其他土壤水分處理下從12月26日（日平均溫度：-21℃）至2月4日細胞均全部失活。濟麥22葉鞘在15%±2%、30%±2%、45%±2%和對照CK（35%～40%）4個水分處理下，分別在12月2日（日平均溫：-17.5℃）、1月14日（日平均溫度：-22.5℃）、12月26日、1月14日時細胞全部失活，而葉片細胞則分別在12月2日、12月2日、12月2日和12月26日全部失活。綜上可知，同一土壤水分處理下，受負積溫變化影響，抗寒性弱品種對低溫反應(yīng)更為敏感，即在封凍早期受低溫傷害即較明顯，而抗寒性強品種要在進入封凍期后一段時間才表現(xiàn)出低溫傷害，所以利用中性紅染色法鑒定育種材料抗寒性時，除要求外部環(huán)境均勻一致外，還應(yīng)在不同時期進行鑒定，這樣才能更好區(qū)別多個育種材料間抗寒性差異，可在封凍初期、進入封凍期后10 d以及進入封凍期后20 d分別進行鑒定。品種間比較，隨著取樣日期的延后，兩個品種葉片、葉鞘的死細胞比例都有逐漸增大趨勢，在低溫馴化期和封凍初期，細胞活力受品種影響較小，從封凍后20 d開始，東農(nóng)冬麥1號細胞活力要高于濟麥22。從取樣部位上來看，本試驗中，同一品種上，葉鞘檢測出活細胞的取樣次數(shù)多于葉片，說明地上部感受溫度要比地下部低，地上部細胞所受傷害大，葉鞘細胞活力好于葉片。

3.2 土壤水分對細胞活力的影響

水分是構(gòu)成植物體的主要組成部分，植物在水分脅迫下會通過自身內(nèi)含物含量和自身結(jié)構(gòu)變化來適應(yīng)脅迫條件，如引起小麥幼苗MDA含量增加[9]、栓皮櫟幼苗葉片SOD活性升高[10]、小麥葉片POD活性增加[11]、水稻功能葉片可溶性蛋白含量增加[12]、小麥根長縮短，根重下降[13]等變化，但當脅迫條件超過其自身承載能力時，對自身造成不可逆?zhèn)?。本研究表明，同一品種同一取樣時期同一部位在不同土壤水分處理下其細胞活力存在較大差異，即在封凍初期（11月11日）抗寒性較強品種在嚴重水分虧缺（15%±2%）條件下其細胞失活也較重，而此時水分適宜條件（CK處理）下抗寒性較弱品種細胞失活較少?？梢姡寥浪謱Ρ３旨毎盍σ饬x重大，土壤水分脅迫會加速低溫條件下冬小麥植株細胞死亡，越冬期間適宜土壤水分（CK，35%～40%）更有利于植株細胞存活，在此水分含量上其細胞活力最大。

[1]佟明耀,鄭家蘭,李卓夫,等.高寒地區(qū)超強抗寒新品種“東農(nóng)冬麥1號”的選育[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(7):1-4.

[2]馮玉磊,王曉楠,付連雙,等.寒地冬小麥返青期抗氧化特性[J].麥類作物學(xué)報,2012,32(3):547-550.

[3]付連雙,王曉楠,王學(xué)東,等.低溫馴化及封凍后不同抗寒性小麥品種細胞超微結(jié)構(gòu)的比較[J].麥類作物學(xué)報,2010,30(1): 66-72.

[4]劉燦,王金偉,李卓夫,等.低溫馴化階段不同抗寒性冬小麥品種生理代謝的比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(11):14-17. [5]王金偉,劉燦,李卓夫,等.低溫馴化期冬小麥生理指標變化的比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(9):1-5.

[6]付連雙,王曉楠,李卓夫,等.土壤水分對冬小麥越冬期間植株電導(dǎo)率的影響[J].作物雜志,2011(3):38-41.

[7]鄒琦.植物生理生化實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995:94-96.

[8]Levitt J.The hardiness of plants[M].New York:Academic,1956: 278.

[9]費明慧.水分脅迫對小麥幼苗生長及抗氧化能力影響[J].吉林師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011(1):43-44.

[10]張文輝,段寶利,周建云,等.不同種源栓皮櫟幼苗葉片水分關(guān)系和保護酶活性對干旱脅迫的響應(yīng)[J].植物生態(tài)學(xué)報,2004, 28(4):483-490.

[11]陳鵬,彭海霞,張靜.水分脅迫對小麥葉片抗病相關(guān)酶活性的誘導(dǎo)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,20(2):56-61.

[12]劉少華,陳國祥,胡艷,等.高產(chǎn)雜交稻“兩優(yōu)培九”功能葉抗氧化系統(tǒng)對水分脅迫的響應(yīng)[J].作物學(xué)報,2004,30(12):1244-1249.

[13]張永清,苗果園.水分脅迫條件下有機肥對小麥根苗生長的影響[J].作物學(xué)報,2006,32(6):811-816.

Difference comparison of winter wheat cell viability under different soil water content treatments

FU Lianshuang1,WANG Xiaonan1,LI Zhuofu1,XIE Dongwei1, SUN Yinglu1,ZHENG Wei2
(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Science,Jiamus Heilongjiang 154007,China)

Dongnongdongmai1 and Jimai22 which were different in cold tolerance were used as experimental materials,and four soil absolute water content such as 15%±2%，30%±2%，45%±2%and normal treatment(CK,35%-40%)were designed,the changes in cell vitality under double effects of low temperature and moisture were studied during over winter.The results showed that cell vitality in leaves and leaf sheath of two varieties were slowly decreased trend with sampling date changing;the cell vitality had significant difference between two varieties in the 20th after freeze up period,and Dongnongdongmai1 was less than Jimai22 in the extent of damage in the cell,under different soil water treatments,the cell vitality was the highest under CK(normal soil water management),and the cell vitality in leaf sheath was better than that in the leaf.

soil water content;cell viability;winter wheat

S572

A

1005-9369（2014）01-0006-11

2013-03-23

黑龍江省高校寒地作物品種改良與生理生態(tài)重點開放實驗室開放基金項目（hdzw-006）；黑龍江省教育廳新農(nóng)村建設(shè)科技服務(wù)項目

付連雙（1978-），男，副教授，博士，研究方向為小麥遺傳育種。E-mail:fulianshuang@163.com

時間2014-1-9 22:49:28[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2249.015.html

付連雙,王曉楠,李卓夫,等.不同土壤水分處理下冬小麥細胞活力差異比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(1):6-16.

Fu Lianshuang,Wang Xiaonan,Li Zhuofu,et al.Difference comparison of winter wheat cell viability under different soil water content treatments[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):6-16.(in Chinese with English abstract)