李 杰，岳苗苗，江連洲，韋素真，姚 楊，張 會

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)生物功能基因黑龍江高校重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

單寧酶基因在黑曲霉中的同源表達

李 杰1,2，岳苗苗1,2，江連洲3，韋素真1,2，姚 楊1,2，張 會1,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)生物功能基因黑龍江高校重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

利用PCR方法從黑曲霉基因組中擴增單寧酶基因的編碼區(qū)，構(gòu)建其黑曲霉表達載體pSZH-tan。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TAN基因?qū)牒谇怪校?jīng)篩選獲得將TNA基因整合到糖化酶基因的同源重組轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析和酶活檢測，結(jié)果表明，重組蛋白分子質(zhì)量約為76 ku，重組菌株單寧酶表達量為322～581 μg·mL-1，最高發(fā)酵酶活為41.12 U·mL-1。

單寧酶；黑曲霉；基因置換；酶活檢測

人類早在1786年就發(fā)現(xiàn)了單寧酶，但直到20世紀60年代才圍繞其在茶飲料工業(yè)中的應(yīng)用展開深入研究[1]。單寧酶（Tannase EC3.1.1.20）全稱單寧酰基水解酶，能水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵[2]，生成葡萄糖沒食子酸及其相應(yīng)醇類等化合物[3-4]。美國食品與藥物管理局（FDA）已確定單寧酶為安全產(chǎn)品，在日本單寧酶也通過批準應(yīng)用于食品工業(yè)[5]。單寧酶可廣泛應(yīng)用于茶、葡萄酒、啤酒及果汁飲料生產(chǎn)，如作為食品添加劑用于開發(fā)茶飲料[6]、啤酒澄清劑、蛋白純化單寧酸去除劑等。單寧酶還可用于制備沒食子酸丙脂抗氧化劑，兒茶素單體和皮革鞣制劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，是一種用途廣泛的酶。

目前，單寧酶應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，市場需求量不斷加大。國外主要采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)單寧酶[7-9]，國內(nèi)主要采用液體發(fā)酵法[10-12]。但是我國單寧酶生產(chǎn)效率偏低，產(chǎn)品酶活多在200 U·g-1，價格卻高達200元·kg-1。本研究擬應(yīng)用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究室建立的食品級黑曲霉分泌表達系統(tǒng)，實現(xiàn)單寧酶基因在黑曲霉中的高效分泌表達，為提高單寧酶的生產(chǎn)效率探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及載體

菌株：黑曲霉CICC2462由肇東市日成酶制劑有限公司提供；大腸桿菌Top10、農(nóng)桿菌AGL1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究室保存；載體：pSZHG由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑及酶類

Prime Star DNA Polymerase、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq酶等均購自大連寶生物（TaKaRa）生物工程有限公司；基因測序由北京六合華大基因有限公司完成；沒食子酸丙酯購自都萊生物科技技術(shù)有限公司；沒食子酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；羅丹寧購自北京百靈威科技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的黑曲霉單寧酶基因tan（XM_001401772）序列信息，以及黑曲霉表達載體pSZHG多克隆位點的特征，用Primer5.0軟件設(shè)計tan基因引物。根據(jù)黑曲霉表達載體pSZH-tan的序列，以及黑曲霉糖化酶基因位點的序列設(shè)計轉(zhuǎn)化子PCR檢測引物及同源重組轉(zhuǎn)化子PCR檢測引物。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this research

1.2.2 基因擴增

以黑曲霉CICC2462基因組DNA為模板，用引物P1、P2分別將擴增得到基因片段。將目的片段tan連接到pMD-18T載體，酶切鑒定，將鑒定正確的結(jié)果送交測序，測序后進行Blast比對分析。

1.2.3 單寧酶基因黑曲霉表達載體pSZH-tan的構(gòu)建

用ApaⅠ、HindⅢ雙酶切載體pSZHG，回收約12 500 bp目的片段，與目的基因tan連接，構(gòu)建黑曲霉表達載體pSZH-tan，如圖1所示。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化

本試驗采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉，利用PCR技術(shù)對黑曲霉轉(zhuǎn)化子進行篩選和鑒定[13]。

1.2.5 重組菌株的發(fā)酵

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉4%、玉米漿20 mL、豆餅粉20 g、葡萄糖10%，250 mL三角瓶裝液量100 mL，進行高溫滅菌，冷卻后將1.2.4篩選得到的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.6 酶活力測定

根據(jù)沒食子酸(單寧酶催化沒食子酸丙酯水解產(chǎn)生)與甲醇羅丹寧之間形成色團物質(zhì)的方法測定單寧酶活性[14]。酶活單位定義：在溫度為30℃條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1 μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位。根據(jù)單寧酶酶活力定義得知，推算酶活計算公式：

式中，U-樣品稀釋液的單寧酶酶活力，（μmol·mL-1）；D-樣品總稀釋倍數(shù)；t-酶解反應(yīng)時間（min）。

圖1pSZH-tan表達載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pSZH-tan

2 結(jié)果與分析

2.1 Tannase基因克隆

以黑曲霉基因組為模板，用引物P1、P2進行PCR擴增，得到大約1 725 bp的特異性條帶，如圖2所示，與預(yù)期結(jié)果相符。將測序結(jié)果進行Blast比對分析，與登錄號為XM_001401772的基因相似性達100%。說明本試驗tannase基因已成功克隆。

圖2tannase基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of tannase gene

2.2 Tannase基因載體構(gòu)建

用ApaⅠ與HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pSZH-tan，可切出約12 500和1 725 bp的片段，說明質(zhì)粒pS? ZH-tan構(gòu)建正確，如圖3所示。

圖3 pSZH-tan表達載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Results of enzyme identification of expression vector pSZH-tan

2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定及篩選

利用引物P3、P4對8株菌進行PCR檢測，其中樣品5號、7號、8號、10號這4株菌可擴增出4 025 bp的目的條帶，是陽性轉(zhuǎn)化子（見圖4），轉(zhuǎn)化率為50%。進一步用引物P5、P6對這4個轉(zhuǎn)化子進行鑒定，都可擴增出1 701 bp的目的條帶（見圖5），為同源重組轉(zhuǎn)化子，同源重組率為100%。

圖4pSZH-tan轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of pSZH-tan transformants by PCR

圖5 同源重組轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of homologous recombination transformants by PCR

2.4 單寧酶酶活力測定

在波長520 nm處沒食子酸濃度與其對應(yīng)的吸光值呈線性相關(guān)，如圖6所示。

圖6 波長520 nm處沒食子酸標準曲線Fig.6 Standand curve of gallic acid at 520 nm

對該組數(shù)據(jù)進行直線回歸分析，得到直線回歸方程：y=0.0007x+0.0006（R2=0.9912），相關(guān)系數(shù)R≈1，表明水解生成物GA濃度(x)與其對應(yīng)的吸光值(y)線性相關(guān)顯著，與保玉心等報道相符[14]。用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)單寧酶重組菌株，取發(fā)酵液上清，進行酶活測定，酶活測定結(jié)果如圖7所示，4株重組菌株最高酶活為41.12 U·mL-1，而出發(fā)菌株酶活最高為2.98 U·mL-1。

圖7 產(chǎn)單寧酶菌株的酶活曲線Fig.7 Curves of enzyme activity producingtannase in the strain

2.5 單寧酶蛋白活性表達

采用黑曲霉出發(fā)菌株作空白對照，并對4株重組菌株進行SDS-PAGE分析，如圖8所示，從蛋白電泳圖可知，在約76 ku處有目的蛋白帶，出發(fā)菌株基本看不見帶。經(jīng)ALPHAIMAGER SYSTEMS軟件分析，蛋白表達量為322～581 μg·mL-1。

圖8 單寧酶發(fā)酵培養(yǎng)基中重組菌株的SDS-PAGEFig.8 SDS-PAGE of recombinant strains in tannase fermentation medium

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)發(fā)展，單寧酶研究不斷深入，國際上已取得重要成果并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，我國需建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的單寧酶重組酶制劑。單寧酶是一種誘導(dǎo)酶，能由某些真菌在沒食子酸等誘導(dǎo)物存在時合成。本試驗利用重組菌株生產(chǎn)單寧酶，不需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加單寧酸或沒食子單寧作為誘導(dǎo)物，排除對單寧酶活力測定的影響，使酶活測定結(jié)果更為簡便、準確[14]。測定過程中即可看到明顯的顏色變化，以沒食子酸丙酯為底物，用甲醇羅單寧便可終止酶活反應(yīng)，無需使用有機溶劑或沸水滅活，避免外界因素對吸光值的干擾，采用常規(guī)儀器便可檢測到產(chǎn)生的微量沒食子酸，提高酶活檢測效果。

本試驗通過基因置換技術(shù)將單寧酶基因定點整合在高表達的糖化酶基因位點，該位點為轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，能夠消除轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)和競爭效應(yīng)，提高表達水平。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉的同源重組效率較高，本試驗陽性轉(zhuǎn)化效率可達50%，同源重組率為100%，為黑曲霉中基因敲除或置換研究提供技術(shù)保障。最高酶活力41.12 U·mL-1，是出發(fā)菌株（2.98 U·mL-1）13.80倍。經(jīng)ALPHAIMAG?ER SYSTEMS軟件分析，SDS-PAGE估測單寧酶實際分子質(zhì)量約為76 ku，大于63.25 ku的理論分子質(zhì)量。根據(jù)NetNGlyc 1.0 Server-prediction results分析單寧酶基因有5處糖基化位點，推測是單寧酶分泌過程中糖基化修飾使其分子質(zhì)量增加。

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Tannasegene homologous expressing inAspergillus niger/

LI Jie1,2,YUEMiaomiao1,2,JIANG Lianzhou3,WEI Suzhen1,2,YAO Yang1,2,ZHANG Hui1,2(1.School of Life Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Agricultural Biological Functional Gene of Heilongjiang Province,Harbin 150030,China;3.School of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Thetannasecoding sequence was amplified fromAspergillusniger by the method of PCR, and then the expression vector PSZH-tan was constructed.TheTANgene transfer byAgrobacterium-mediatedAspergillus niger,theTNAwas screened glucoamylase gene into the gene homologous recombinants. Expression product was analyzed by SDS-PAGE and the enzyme activity was detected,the result showed that the recombinant protein molecular weight was about 76 ku,expression of recombinant strainstannase was 322-581 μg·mL-1,the maximum fermentation activity was 41.12 U·mL-1.

tannase;Aspergillus niger;gene substitution;enzyme activity detection

TQ925；Q786

A

1005-9369（2014）07-0061-05

時間2014-7-7 8:26:37 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.021.html

李杰,岳苗苗,江連洲,等.單寧酶基因在黑曲霉中的同源表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):61-65.

Li Jie,Yue Miaomiao,Jiang Lianzhou,et al.Tannasegene homologous expressing inAspergillus niger[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):61-65.(in Chinese with English abstract)

2014-02-26

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2013AA102104）

李杰（1972-）男，教授，博士，研究方向為分子遺傳學(xué)及基因工程。E-mail:lijie_neau@126.com