武小霞，孫 晶，蘇安玉，李 靜，劉 明，張彬彬，李冬梅，李文濱

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

大豆再生抑制消減雜交文庫的構(gòu)建

武小霞1，孫 晶1，蘇安玉2，李 靜1，劉 明1，張彬彬1，李冬梅1，李文濱1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

大豆再生受基因型限制，高效穩(wěn)定再生體系建立難、遺傳轉(zhuǎn)化效率低，影響生物技術(shù)的應用。為獲得與大豆再生相關(guān)基因，解析大豆再生基因分子機制，從而建立高效、穩(wěn)定再生體系，為生物技術(shù)在大豆分子育種中的應用奠定基礎(chǔ)。文章利用抑制性消減雜交技術(shù)（Suppression subtractive hybridization，SSH），以東農(nóng)50子葉節(jié)為材料構(gòu)建消減雜交cDNA文庫，從文庫中隨機挑取917個陽性克隆，PCR鑒定插入片段大部分集中在100～750 bp，利用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列相似性比對，經(jīng)過同源性比對歸并后得到411個高質(zhì)量ESTs片段，功能分析表明，這些基因與信號轉(zhuǎn)導、葡萄糖、蛋白質(zhì)大分子生物合成代謝，光、葉形態(tài)發(fā)生相關(guān)；調(diào)控細胞凋亡、細胞自身防御、細胞壁分化；參與各種激素及細胞分裂素介導的信號通路。

大豆；抑制消減雜交（SSH）；cDNA文庫；再生

大豆再生頻率低，重復性差，是公認的難轉(zhuǎn)化作物。自Hinchee等[1]和McCabe等[2]分別用農(nóng)桿菌介導法和基因槍法成功轉(zhuǎn)化大豆獲得轉(zhuǎn)基因植株以來，一直無突破性進展。對大豆再生體系發(fā)生機理和分子基礎(chǔ)及再生過程中起作用基因研究很少，如果能得到控制或調(diào)節(jié)大豆再生基因并加以研究，有望解決大豆再生能力低難題。

抑制消減雜交技術(shù)（SSH）技術(shù)是Diatchenko等于1996年結(jié)合抑制PCR（Suppression PCR）技術(shù)和消減雜交法建立[3]的鑒定和分離組織、細胞中選擇性表達基因的技術(shù)，是富集和分離差異基因較成熟的方法，以抑制性多聚酶鏈反應（PCR）為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交技術(shù)[4]。抑制消減雜交技術(shù)應用雜交二級動力學原理[5-6]，不僅利用消減雜交技術(shù)消減富集作用，也利用抑制性PCR達到更高效率富集。能分離高、低豐度差異表達基因，并具有假陽性率低、敏感性高、篩選周期短、效率高、簡便易行優(yōu)點。

SSH技術(shù)已廣泛應用于國內(nèi)外動、植物研究領(lǐng)域。劉軍等為分離水稻幼穗發(fā)育早期特異表達基因，以水稻莖尖分生組織（Shoot apical meristem，SAM）為對照樣本、幼穗分生組織（Primary and sec?ondary branch primordia，Pb）為目標樣本進行抑制消減雜交，獲得40個在Pb中能特異表達或增強表達候選基因[7]。郭新紅等為獲得與滲透脅迫相關(guān)基因，以Hoagland溶液培養(yǎng)梭梭幼苗為對照樣本，甘露醇處理的梭梭幼苗為目標樣本進行抑制消減雜交，得到含約400個陽性克隆的消減文庫[8]。Feng等將受精后的棉纖維作為檢測子，未受精植株的相同部位為驅(qū)動子，構(gòu)建減cDNA文庫，分離出富含脯氨酸的蛋白（RPRs）、阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）、棒曲霉素、微管蛋白及脂類遷移蛋白（LTPs）五大家族基因[9]。張雷等從調(diào)控12 h胡蘿卜體細胞胚cDNA文庫中獲得與胡蘿卜體細胞胚根發(fā)育相關(guān)基因[10]。李沖等將冬眠馬鈴薯發(fā)芽部位作為檢測子，塊莖部位作為驅(qū)動子構(gòu)建消減cDNA文庫，找出與生長調(diào)節(jié)相關(guān)基因，著重研究生長因子ARF6基因，證實與植物發(fā)芽有關(guān)[11]。

Low等以泡桐為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)差減出再生候選基因PKSF1，PKSF1主要是編碼亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，促進愈傷組織形成[12]。近年來，對體細胞胚和子葉節(jié)再生相關(guān)基因有過報道，Zubko等在矮牽牛中得到Sho再生候選基因，Sho能促進細胞分裂素途徑中關(guān)鍵酶異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPTs）增加[13]。Komatsuda等通過QTL定位方法獲得與不定芽再生有關(guān)基因Shd1[14]。Zakizadeh等在玫瑰中分離出再生候選基因RhSERK1-4，該基因與體細胞胚胎發(fā)生受體激酶（SERK,the somatic embryogenesis receptor-like kinase）表現(xiàn)出高度的序列相似性[15]。研究發(fā)現(xiàn)RhSERK3和RhSERK4與體細胞胚胎發(fā)生有關(guān)[16]。

在擬南芥中，再生過程調(diào)控的研究相對較多，Banno等在擬南芥中克隆出可促進再生ESR2基因，ESR1和ESR2均是具有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[17]。ESR2調(diào)控過程報道，認為ESR2通過調(diào)控CUC1基因來控制擬南芥再生[18]；除ESR基因外，WUSCHEL基因家族通過對細胞分裂素應答元件的調(diào)控，控制體細胞胚的發(fā)生[19]，在大豆中尚無克隆出調(diào)控再生相關(guān)基因的報道。

大豆組織培養(yǎng)工作在20世紀80年代中、后期才有突破性進展。大豆經(jīng)器官發(fā)生再生植株最早是由Kartha等報道，外植體采用栽培大豆真葉[20]。Barwale等通過體細胞胚成功獲得植株再生，大豆體細胞胚胎再生體系獲得初步成功[21]。之后對外植體種類、取材時間、誘導激素種類和濃度等能影響大豆體細胞胚胎發(fā)生因素進行深入研究。本試驗是以大豆東農(nóng)50子葉節(jié)為材料，在細胞分裂素6-BA誘導下，抑制消減雜交出差異基因，對這些基因進行功能分析，以期獲得再生相關(guān)基因。即從子葉節(jié)器官發(fā)生途徑結(jié)合激素對大豆再生途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達影響，分析再生基因在再生體系中的作用，尋找再生基因并對基因進行克隆和改造，從分子水平上分析基因功能并研究其作用機理，為發(fā)掘大豆再生基因，提高大豆再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率提供理論依據(jù)，為提高我國大豆綜合產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

東農(nóng)50由東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所提供，是具有較高再生能力的大豆品種，氯氣滅菌后種臍向下接種到萌發(fā)培養(yǎng)基（4.43 g MS，3%蔗糖，0.7%瓊脂，pH 5.8）中,25℃光照培養(yǎng)箱，16 000 lx白光，長日照（16 h/8 h，光/暗）培養(yǎng)5～7 d后取出無菌苗，去掉種皮，切去大部分下胚軸，只留靠近子葉的3～5 mm下胚軸，將2片子葉從下胚軸中線處切開，除去頂芽和腋芽，得到子葉節(jié)外植體。將一部分子葉節(jié)外植體接種到添加6-BA的液體培養(yǎng)基（4.43 g MS+2 mg L-16-BA,3%蔗糖，pH 5.8）中，處理1～10 h取樣作為SSH tester；另一部分子葉節(jié)外植體接種在不添加6-BA的液體培養(yǎng)基中，同樣處理1～10 h取樣作為SSH driver，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 化學藥品及試劑

CLONTECH SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit和 CLONTECH PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit購自CLONTECH公司；Trizol試劑、pMD 18-T、LATaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL8000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；電泳用瓊脂糖（Agarose）為西班牙進口試劑；其他各種生化試劑均為國產(chǎn)分析純；測序由華大基因組（BGI）完成。

1.3 方法

1.3.1 抑制消減雜交文庫的構(gòu)建[22]

選擇Trizol試劑法提取大豆子葉節(jié)的總RNA。以細胞分裂素6-BA處理的子葉節(jié)cDNA為Tester，未經(jīng)過6-BA處理的子葉節(jié)為Driver，參照CLON?TECH SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit說明書上的方法，利用SMART技術(shù)將Tester和Driver兩個樣本各小時總RNA混合在一起，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過LD-PCR選擇最佳擴增狀況的循環(huán)數(shù)，確保雙鏈cDNA處于對數(shù)擴增階段。參照CLONTECH PCRSelectTMcDNA Subtraction Kit的說明進行抑制性消減雜交。先將Tester-cDNA用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切，平分成兩份分別連接接頭1和接頭2R，16℃溫育過夜后，將連有接頭的Tester和Driver分別與RsaⅠ酶切的driver-cDNA進行第1次雜交，98℃溫育90 s，68℃雜交8 h，再向第1次消減雜交體系混合物中加入過量新鮮熱變性driver cDNA進行第2次雜交，68℃溫育過夜，加入200 μL的稀釋緩沖液后68℃溫育7 min即可。繼爾進行第1次和第2次巢式PCR擴增。巢式PCR反應25 μL PCR反應體系如下：雜交樣品1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.5 μL，上下游Nested PCR Primer各1 μL，LA DNA聚合酶 （5 U·L-1）0.5 μL，無菌水18.5 μL；進行巢式PCR擴增，94℃變性10 s，68℃復性 30 s，72℃延伸1.5 min。

將巢式PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD-18T載體連接，16℃過夜，使用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Esch?erichia coli）DH5α感受態(tài)細胞，接種于含有X-gal/ IPTG/Amp的固體LB培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選，挑取白色單斑接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)，挑取單斑，進行菌液PCR鑒定，引物為巢式PCR引物，Nested PCR Primer1（5′TCGAGCG CCGCCCGGGCAGGT 3′）和Nested PCR Primer2R（5′AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3′），進行菌液PCR鑒定，PCR反應25 μL混合體系如下：菌液2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.5 μL，Primer1和Primer2R引物各0.5 μL，LA DNA聚合酶（5 U·L-1） 0.3 μL，無菌水18.7 μL。進行PCR擴增反應，94℃預變性5 min；30個循環(huán)：94℃變性30 s，68℃復性30 s，72℃延伸2 min；72℃終延伸5 min。將鑒定為陽性克隆的菌液按1∶1加30%甘油，于-80℃中保存菌種。

1.3.2 ESTs測序與序列結(jié)果分析

將隨機挑取的陽性克隆送至北京華大基因測序，EST（Expressed sequence tag）是從一個隨機選擇cDNA克隆進行5′端和3′端單向測序，獲得cD?NA的部分序列，代表一個完整基因的一部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度從20到7 000 bp不等，平均長度400 bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA構(gòu)建的cDNA文庫，因此EST也能說明該組織中各基因的表達水平，序列經(jīng)過去載體、宿主序列重復序列后進行拼接，所得EST片段利用NCBI和PHYTOZOME的BLAST（Basic local alignment aearch tool）比對進行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆子葉節(jié)總RNA的提取

大豆子葉節(jié)總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S、18S和5S條帶清晰RNA（見圖1）。

2.2 SMART技術(shù)合成cDNA

SMART（Switching mechanism at 5 end of the RNA transcript）技術(shù)是利用真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”而擴增得到全長的cDNA，并經(jīng)過PCR方法得到處于對數(shù)期擴增階段擴增情況最佳的雙鏈cDNA，既不因循環(huán)次數(shù)過少而喪失過多的低拷貝數(shù)基因，又不會因循環(huán)次數(shù)太多而產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。選取能夠代表原有樣品中mRNA豐度的cDNA樣品。

試驗中Tester在第30個循環(huán)時顯示擴增效率降低，故采用27個循環(huán)進行cDNA擴增；而Driver在第27個循環(huán)時顯示低擴增效率，所以采用24個循環(huán)進行cDNA擴增（見圖2）。

圖1 大豆子葉節(jié)總RNA的提取Fig.1 Total RNA extraction from soybean cotyledonary node

圖2 Tester和Driver的cDNA PCR擴增結(jié)果Fig.2 Results of cDNA PCR amplification of Tester and Driver

2.3 雙鏈cDNA的RsaⅠ酶切結(jié)果

RsaⅠ酶是四堿基內(nèi)切酶，約256 bp，有1個酶切點，能將雙鏈cDNA酶切成較小的cDNA片段，小片段可降低雜交過程中形成的復雜二級結(jié)構(gòu)對雜交的阻礙作用，提高不同基因檢出率，防止長cDNA片段對消減雜交干擾（見圖3）。

2.4 消減雜交后兩次PCR擴增的結(jié)果分析

在雜交液中進行第1次雜交，雜交結(jié)束后會形成4種雜交產(chǎn)物：a是均一化差異表達單鏈Tester cDNA；b是自身退火的Tester cDNA雙鏈；c是異源退火的Tester和Driver cDNA；d是Driver cDNA。將兩份第1次雜交樣品進行混合，再加入新鮮熱變性Driver cDNA在緩沖液中進行第2次雜交，進一步除去共有序列，第1次雜交時在退火中形成均一化連接不同接頭的差異表達單鏈Tester cDNA特殊類型分子e，第2次雜交補平接頭末端[23]。加入adapter 1和adapter 2R的部分特異序列進行PCR擴增，第1次PCR擴增時a和d沒有引物結(jié)合位點故不能進行擴增；b兩端連有相同的接頭，接頭上有反向重復序列抑制PCR也不能進行擴增；而c是單接頭，只能進行線性擴增；只有兩端連接有不同接頭雙鏈DNA分子e才可進行擴增，擴增產(chǎn)物即為目的片段。第2次PCR擴增使接頭內(nèi)側(cè)的引物選擇性擴增目的片段，經(jīng)過兩次雜交和兩次Nested PCR，目的片段即被消減并富集，得到長度在200～1 400 bp均勻彌散狀片段，平均在400～700 bp（見圖4）。

圖3 雙鏈cDNA的RsaⅠ酶切結(jié)果Fig.3 Results of RsaⅠenzyme cutting double chain cDNA

圖4雜交后兩次PCR擴增結(jié)果Fig.4 Twice PCR products after subtraction

2.5 PCR擴增的消減文庫中的插入片段

經(jīng)SSH消減并富集得到的cDNA片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選藍白班，隨機挑取917個克隆，PCR檢測表明大多數(shù)插入片段長度在100～750 bp（見圖5）。

2.6 EST測序與同源性檢索結(jié)果

隨機獲得的917個克隆，其中高質(zhì)量EST 411個，占總數(shù)的44.8%。將測序結(jié)果到GenBank進行BLASTn和BLASTx比對，基因功能涉及信號轉(zhuǎn)導，葡萄糖、蛋白質(zhì)大分子生物合成代謝，光、葉形態(tài)發(fā)生，細胞凋亡、細胞自身防御、細胞壁分化，各種激素及細胞分裂素介導的信號通路，具體見表1、圖6。

圖5 消減文庫中插入片段檢測Fig.5 Screening of the inserts in of subtractive library

表1 部分ESTs與GenBank已知基因同源性比較結(jié)果Table 1 Similarity analysis of ESTs comparing with genes in GenBank

圖6ESTs比對結(jié)果分類Fig.6 Classification result of the ESTs

3 討論與結(jié)論

本試驗采用抑制消減雜交技術(shù)，構(gòu)建細胞分裂素誘導大豆子葉節(jié)的差異表達cDNA消減文庫，對于研究大豆器官發(fā)生再生途徑及篩選大豆再生候選基因具有重要意義。對比其他消減雜交文庫構(gòu)建，本試驗對試驗材料與方法進行優(yōu)化，以小時為時間點取材，能夠更密集消減雜交出有差異變化的基因，隨機挑取917個陽性克隆，文庫構(gòu)建足夠大，可更全面、準確地挑出有變化基因。

抑制消減雜交方法可彌補其他消減雜交方法缺點和不足，克服分離單雙鏈DNA操作難問題，抑制PCR擴增使差異表達的基因達到均一化，而進行2次抑制PCR能使表達豐度不同差異表達片段有效富集。SSH只用2次消減雜交和2次抑制PCR即可有效獲得特異擴增差異表達的目的片段，操作簡單快捷、靈敏度高、假陽性頻率低。但SSH也存在局限性，需要的初始材料較多，1次只能對2個樣品進行雜交，只能分離在Tester中表達而在Driver中不表達的基因[24]。

目前，對植物再生相關(guān)基因研究較少，但在模式植物擬南芥、水稻等植物中已有調(diào)控再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或基因相關(guān)報道。本研究擬通過現(xiàn)代分子生物學技術(shù)從根本上提高大豆的再生能力，解決大豆再生體系建立難、轉(zhuǎn)化難問題。關(guān)于植物再生相關(guān)基因的克隆在國內(nèi)外報道甚少，而大豆再生相關(guān)基因克隆更是未見報道。因此，如果找到控制大豆再生基因，將會對大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生深遠影響。此外，對于大豆再生以及發(fā)育分子機制，國內(nèi)外研究甚少，本研究分析再生相關(guān)基因在組織中的表達及外源激素變化對其影響，可為探明大豆再生及發(fā)育機制提供理論依據(jù)。

本研究目標是尋找調(diào)控大豆再生的關(guān)鍵遺傳基因，為最終解決大豆再生難、轉(zhuǎn)化難等問題奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建大豆器官發(fā)生再生途徑抑制性消減雜交（SSH）文庫，在已獲得ESTs序列基礎(chǔ)上，將進行大豆再生相關(guān)基因克隆和功能分析，在轉(zhuǎn)基因條件下研究再生基因表達及功能和激素信號轉(zhuǎn)導對大豆再生的影響。

對大豆再生抑制消減雜交文庫中的ESTs進行基因比對分析發(fā)現(xiàn)，細胞分裂素誘導下發(fā)生變化的基因按功能可分為，感知各種激素的信號轉(zhuǎn)導通路、影響種子萌發(fā)和開花時間、細胞程序性死亡負調(diào)控、葉片衰老、花粉管伸長、葡萄糖、蛋白質(zhì)等大分子生物合成及代謝、光合作用、核糖體、轉(zhuǎn)運蛋白、過氧化氫酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶等類別；還發(fā)現(xiàn)與冷、熱、干旱、高鹽、機械損傷脅迫有關(guān)的大量基因以及一些未知基因。其中一些基因通過RT-PCR試驗結(jié)果表明，在受細胞分裂素誘導后差異表達明顯；參與激素信號轉(zhuǎn)導途徑的基因很有可能與植物再生有相關(guān)作用，后續(xù)試驗將進一步研究。

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Construction of SSH library of regeneration related gene in soybean

It is the world recognized challenge to set up genetic transformation of soybean regeneration system with the problem of low efficiency.In order to establish a highly efficient and stable regeneration system,in this study,cotyledonary node of DN50 were used to construct suppression subtractive cDNA library,and 917 positive clones were screened.The length of most of the insert fragments was focused on 100-750 bp.For further ESTs screening,411 differentially expressed functional ESTs were found and predicted by BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)in GenBank.The ESTs were annotated by similarity to orthologs and paralogs detected with Blastn and Blastx.Function analysis showed that genes were annotated by similarity to signal transduction,macromolecules glucose,and protein synthesis and metabolism,light and leaf morphogenesis,regulation of apoptosis,the cell defense,and cell wall differentiation,participate in a variety of hormones and cytokinin-mediated signaling pathways.

soybean;suppression subtractive hybridization(SSH);cDNA library;regeneration

S565.1

A

1005-9369（2014）07-0038-07

時間2014-7-4 17:26:30 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.009.html

武小霞,孫晶,蘇安玉,等.大豆再生抑制消減雜交文庫的構(gòu)建[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(7):38-44.

Wu Xiaoxia,Sun Jing,Su Anyu,et al.Construction of SSH library of regeneration related gene in soybean[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):38-44.(in Chinese with English abstract)

2014-01-09

國家自然科學基金資助項目（31071438）；黑龍江省自然科學基金項目（ZD201117）；黑龍江省教育廳重點項目（12531z001）

武小霞（1971-），女，研究員，博士，博士生導師，研究方向為大豆遺傳育種與生物技術(shù)應用。E-mail:xxwu2012@126.com

WU Xiaoxia1,SUN Jing1,SU Anyu2,LI Jing1,LIU Ming1,ZHANG Binbin1,LI Dongmei1,LI Wenbin1(1. School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education,Harbin 150030,China;2.Shool of Resources and Environmental Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)