劉娣，尹雪，張冬杰，汪亮，孫亞蒙，張曉卉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

豬卵泡抑素基因特異表達載體的構(gòu)建及鑒定

劉娣1,2，尹雪1，張冬杰2，汪亮2，孫亞蒙1，張曉卉1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

采用RT-PCR方法擴增豬的FST基因完整編碼區(qū)，采用雙酶切和連接方法構(gòu)建可在肌肉細胞中特異表達的真核載體，并轉(zhuǎn)染C2C12細胞系進行驗證。結(jié)果表明，豬FST基因全長1 032 bp，與網(wǎng)上已提交序列相似度為99.13%，成功構(gòu)建可在肌肉細胞中特異表達的真核載體pEGFP-C1-α-actin-FST，轉(zhuǎn)染C2C12細胞后，通過實時定量PCR檢測，表明FST基因過表達可抑制MSTN基因表達。

豬；卵泡抑素基因；特異表達載體；實時定量PCR；過表達

卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）又名FSH抑制蛋白，是一種單鏈糖蛋白[1]，F(xiàn)ST基因全長約6 kb，含6個外顯子和5個內(nèi)含子，第1外顯子編碼一個長29個氨基酸的片段，4個外顯子分別編碼FST的4個功能區(qū)，一個卵泡抑素前體有344個氨基酸，但最后一個功能區(qū)編碼27個氨基酸可能會脫去而形成另外含317個氨基酸的前體[2-3]。FST具有多種生物學(xué)功能，對轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor，TGF）β超家族成員成員具有拮抗作用，可與肌肉抑制素結(jié)合，調(diào)節(jié)肌肉細胞生成。肌肉抑制素基因是一種骨骼肌生長的負調(diào)控因子，降低該基因表達或者抑制該基因活性能夠促進骨骼肌生長，應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)上可提高動物的產(chǎn)肉能力[4]。近年有研究發(fā)現(xiàn)FST過表達會導(dǎo)致動物肌肉產(chǎn)量增加[5]，F(xiàn)ST缺失導(dǎo)致肌肉發(fā)育不良[6]。Lee等將人的FST克隆到肌肉特異表達載體中，通過顯微注射和胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠都發(fā)生肌肉增生和肌肉肥大，肌肉重量是野生小鼠的194%～327%[7]。

鑒于FST基因?qū)Σ溉閯游锏募∪饧毎L具有顯著效應(yīng)，本研究對豬的FST基因進行克隆測序，并構(gòu)建可在肌肉細胞中特異表達的真核載體，以期為今后豬FST基因的功能研究及轉(zhuǎn)基因豬培育提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞

pGL3-basic質(zhì)粒、PEGFP-C1質(zhì)粒、小鼠骨骼肌細胞（C2C12）均來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所；pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑

rTaq聚合酶、KpnⅠ、HindⅢ購自TaKaRa公司；NheⅠ、AgeⅠ購自NEB公司；無內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 豬FST基因編碼區(qū)的克隆測序

利用Primer5.0軟件，根據(jù)GenBank上已提交的豬FST基因序列設(shè)計引物F1和R1（見表1），上下游引物兩端分別添加KpnⅠ和HindⅢ酶切位點。利用常規(guī)PCR擴增目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，連入T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，LB固體培養(yǎng)及過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落鑒定后，送交Invitrogen公司測序。

1.2.2 豬α-actin基因啟動子核心區(qū)域的確定

豬α-actin基因啟動子核心區(qū)域位于-1 089～-821 bp之間[8]，本研究利用Primer 5.0軟件，設(shè)計1對可用于擴增α-actin基因啟動子核心區(qū)域的引物F2和R2，上下游分別引入NheⅠ和AgeⅠ酶切位點（見表1）。將該片段連入T載體，克隆測序證明序列正確后，經(jīng)雙酶切，連入pEGFP-C1載體，構(gòu)建pEGFP-C1-α-actin質(zhì)粒。以該質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物F3和R3，上下游分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點（見表1），擴增質(zhì)粒上的CMV（巨細胞病毒）序列和引入的α-actin基因序列，將該片段再次連入T載體，構(gòu)建pMD18-T-CMV-α-actin質(zhì)粒，送交公司測序。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒，使用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后得到的CMV-α-actin片段連入pGL3-basic載體，構(gòu)建pGL3-basic-CMV-α-actin質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）檢測報告基因的表達水平，RLA數(shù)值為3次重復(fù)，試驗結(jié)果平均值±標準差，具體操作步驟參見Promega檢測試劑盒說明書。

1.2.3 豬FST基因肌肉細胞特異表達真核載體的構(gòu)建

以構(gòu)建成的pMD18-T-FST和pEGFP-C1-αactin質(zhì)粒為模板，使用KpnⅠ和HindⅢ分別進行雙酶切，將目的片段回收后，使用T4連接酶，將豬的FST基因片段連入pEGFP-C1-α-actin質(zhì)粒，構(gòu)建pEGFP-C1-α-actin-FST質(zhì)粒。

1.2.2FST基因真核表達載體的轉(zhuǎn)染及相關(guān)基因的Real-time PCR檢測

將pEGFP-C1-α-actin-FST質(zhì)粒采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank上已提交的鼠的生肌決定因子（MyoD），肌細胞生成素基因（MyoG），肌肉抑制素基因（MSTN），生長分化因子11（GDF11），管家基因（GAPDH）基因序列設(shè)計引物（見表1），利用相對定量Real-time PCR方法檢測在C2C12細胞中過表達FST基因后上述基因表達變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬FST基因序列

PCR克隆測序后顯示，豬的FST基因完整編碼區(qū)長1 032 bp，與網(wǎng)上已提交的豬FST基因序列相似度達99.13%。說明目的片段擴增正確。

2.2 豬α-actin基因啟動子核心區(qū)域的雙熒光素酶檢測結(jié)果

在α-actin基因啟動子核心區(qū)的前端引入CMV強啟動子，連入pGL3-basic，轉(zhuǎn)染C2C12細胞后，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，CMV+α-actin可有效啟動熒光素酶的表達（見圖1）。

表1 引物介紹Table 1 Primer introduction

圖1 雙熒光素酶活性測定結(jié)果Fig.1 Dual luciferase activity measured results

2.3 豬FST基因真核表達載體的鑒定結(jié)果

pEGFP-C1-α-actin-FST質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，可獲得1條長約1 000 bp片段，與已知的FST片段大小一致；pEGFP-C1-α-actin-FST質(zhì)粒經(jīng)AseⅠ和AgeⅠ雙酶切后，可獲得1條長約1 000 bp片段，與已知的CMV（594 bp）+α-actin（420 bp）片段大小一致（見圖2），測序結(jié)果表明連入的片段正確。

2.4 相關(guān)基因的相對表達量

由圖3可知，F(xiàn)ST基因過表達后，MYOD、MYOG、MSTN、GDF11的表達也均上調(diào)，通過SPSS軟件分析其中FST和MSTN表達量極顯著升高（P＜0.01），MYOD表達量顯著升高（P＜0.05），MYOG、GDF11表達量無顯著變化。

圖2 p-EGFP-C1-α-actin-FST載體的酶切鑒定Fig.2 p-EGFP-C1-α-actin-FST carrier restriction endonuclease

圖3 Real-time PCR檢測相關(guān)基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of related genes by Real-time PCR detection

3 討論與結(jié)論

天然啟動子種類繁多且各具特點。有些啟動單基因轉(zhuǎn)錄，而另外一些與多個基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)[9]。在進行基因重組體外表達研究時，可采用增加啟動子的數(shù)目提高外源基因表達效率[10-12]。劉京鴿等研究發(fā)現(xiàn)，CMV或者是SV40可顯著改善豬骨骼肌特異性表達基因α-actin啟動子活性，其中啟動子CMV效果尤其明顯[8]。本試驗構(gòu)建組成型啟動子CMV加α-actin基因啟動子核心區(qū)域雙啟動子載體，通過雙熒光素酶的檢測證明雙啟動子載體的活性確實很高，這與劉京鴿等研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細胞中過表達豬FST基因后，MSTN基因表達顯著升高，這與Kocamis、岳群華等研究結(jié)果相同[13-14]。原因是FST通過與MSTN直接結(jié)合而阻止MSTN行使生物學(xué)功能，這種FST對MSTN抑制作用是通過改變表達形式而發(fā)揮作用。但如果FST持續(xù)高表達，會通過負反饋機制引起MSTN表達增加，但FST增加仍會抑制增加的MSTN與受體結(jié)合及其生理功能，促進骨骼肌發(fā)育。因此，肌肉仍然表現(xiàn)旺盛生長狀態(tài)，細胞電子體積增加。因此可通過調(diào)節(jié)FST基因表達促進骨骼肌生長。本研究成功構(gòu)建一個可在豬肌肉組織中特異表達真核載體p-EGFPC1-α-actin-FST，人工合成雙啟動子的啟動效率顯著提高；在C2C12細胞中，F(xiàn)ST基因過表達可顯著提高MSTN基因的表達，促進骨骼肌細胞生長。

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Pig follistatin gene-specific expression vector and identification/LIU Di1,2,

YIN Xue1,ZHANG Dongjie2,WANG Liang2,SUN Yameng1,ZHANG Xiaohui1(1.School of Animal Sciences and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Institute of Animal Husbandry,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

RT-PCR was used to amplify the entire coding region of theFSTgene pigs,With double enzymes and the connection method to build can be specific in the muscle cells of eukaryotic expression vector,and transfected C2C12cells for verification.The results showed that pigsFSTgene was 1 032 bp,with the online submitted was 99.13%sequence similarity,successfully constructed a specific expression in the muscle cells of the eukaryotic expression vector pEGFP-C1-α-actin-FST, transfected C2C12cells,by Real-time quantitative PCR,showed overexpressionFSTcould inhibitMSTN gene expression.

pig;FST;specific expression vector;Real-time PCR;overexpression

S828；Q782

A

1005-9369（2014）05-0083-04

2013-12-03

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2011ZX08006-003）；國家生豬產(chǎn)業(yè)體系崗位科學(xué)家項目（CARS-36）

劉娣（1963-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail:liudi1963@163.com

時間2014-5-12 9:02:03[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0902.023.html

劉娣,尹雪,張冬杰,等.豬卵泡抑素基因特異表達載體的構(gòu)建及鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(5):83-86.

Liu Di,Yin Xue,Zhang Dongjie,et al.Pig follistatin gene-specific expression vector and identification[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):83-86.(in Chinese with English abstract)