李廣興，王新，潘龍，杜威威，黃小丹，孫剛，楊貴君，任曉峰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090）

IBV HH06株N基因原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

李廣興1，王新1，潘龍1，杜威威1，黃小丹2，孫剛3，楊貴君1，任曉峰1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090）

雞傳染性支氣管炎（Avian infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病。試驗(yàn)根據(jù)NCBI發(fā)表的IBV基因序列設(shè)計引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增病毒的N基因，并將其導(dǎo)入pET-30a（+）載體中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。SDS-PAGE及Western-blot檢測結(jié)果表明，重組蛋白得到表達(dá)并能與IBV陽性血清有很好的反應(yīng)性。以純化后的重組蛋白作為包被抗原，在包被量為2.5 μg·mL-1、血清1∶40倍稀釋條件下，建立并優(yōu)化間接ELISA檢測方法。臨床樣品檢測表明，該方法可高效檢測出IBV抗體，并與IBV病毒作為包被抗原ELISA檢測結(jié)果一致，為IB的快速診斷及流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

雞傳染性支氣管炎病毒；N基因；原核表達(dá)；間接ELISA

Key words:Infectious bronchitis virus;N protein;prokaryotic expression;indirect ELISA

雞傳染性支氣管炎（Avian infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病[1]。IBV是尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬成員之一?；蚪M為不分節(jié)段單股正鏈RNA，長27.6 kb，病毒粒子帶有囊膜和纖突。IBV基因組有10個明顯的開放閱讀框，主要編碼病毒的4種結(jié)構(gòu)蛋白，即S蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白以及一些非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。目前，IBV基因定位順序?yàn)?' 1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-PolyA 3'[3]。1930年在美國北達(dá)科塔州IB首次被發(fā)現(xiàn)，我國于1972年由鄺榮祿等在廣東首次發(fā)現(xiàn)本病。目前世界上已分離出30多個血清型。由于新的血清型不斷出現(xiàn)，給IB的防治帶來一定困難。Agustina等對阿根廷2001～2008年所分離的20株毒株相關(guān)蛋白核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，僅發(fā)現(xiàn)5株分離株屬于Massachusetts型或Connecticut型，其他毒株分成3個群，且生成群之間沒有相關(guān)性和地理格局，這些結(jié)果可說明以Mass血清型疫苗免疫計劃控制IB失敗的原因[4]。目前對于IBV研究主要集中在病毒遺傳變異和致病機(jī)制研究，其中以S蛋白在病毒與宿主細(xì)胞相互作用及其分子特征最為活躍，但是由于S蛋白高度變異使其在該病的快速準(zhǔn)確診斷方面受限制。IBV N蛋白是病毒內(nèi)核衣殼蛋白，是一種磷酸化蛋白，不能被糖基化，由409個氨基酸組成，分子質(zhì)量為46 ku，在進(jìn)化上最為保守。在IBV感染過程中，N蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的ELISA抗體出現(xiàn)最早，效價最高，還可引起細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答[5]。因此，N蛋白對IB的診斷防治和新型基因工程疫苗研究是穩(wěn)定的免疫原。本研究將IBV分離株HH06的N基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a（+）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以純化的重組蛋白作為包被抗原初步建立IBV抗體間接ELISA檢測方法，為今后IB快速診斷和流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、菌株、血清及雞胚

克隆載體pMD18-T（50 ng·μL-1）購自大連寶生物工程公司；pET-30a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌JM109、Rossetta感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；9～11日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大腸桿菌陽性血清及沙門氏菌陽性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所劉思國研究員惠贈；AIV陽性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所王秀榮研究員惠贈；IBV雞陽性血清、NDV陽性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室劉勝旺研究員惠贈；ALV陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；IBV血清臨床樣本由黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所提供。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、ExTaq酶、DNA Marker、低蛋白Marker（購自大連寶生物工程公司）；HRP標(biāo)記兔抗雞IgG二抗（購自北京博奧森公司）；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）。瓊脂糖購自Biowest公司；溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）、4-氯-1-萘酚、牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）均購自Sigma公司；96孔酶標(biāo)板購自廣州潔特生物過濾制品有限公司。

試驗(yàn)所用其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成

本試驗(yàn)共需兩對引物，首先設(shè)計克隆引物，參考NCBI上發(fā)表的雞傳染性支氣管炎病毒SC021202設(shè)計一對引物，上游引物HH06-N up：5'CGCT CAATCGCTGGTATG 3'；下游引物HH06-N down：5'CGGCACTGGCGTCTTTAT 3'，包含完整N基因閱讀框；之后又根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計一對針對N基因的亞克隆引物：上游引物S：5'CCGGAATTCATGGCA AGCAGTAAGGCA 3'（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物P：5'CCGCTCGAGTCAAAGTTCA TTTTCACC 3'（下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），兩對引物均由哈爾濱博仕生物技術(shù)公司合成。

1.4 病毒基因組RNA提取及N基因擴(kuò)增

將IBV HH06株接種于9～11日齡SPF雞胚中，接種劑量0.1 mL·胚-1，棄去24 h內(nèi)死亡胚，72 h后收集尿囊液。用Trizol方法提取病毒基因組RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以HH06-N up和HH06-N down為引物，cDNA為模板進(jìn)行N基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；55.7℃30 s；72℃2 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化，與pMD18-T載體連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-N，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，12 h后挑取形態(tài)規(guī)則、大小均一的菌落。用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并用菌液PCR和EcoRⅠ、PstⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.5 N基因的亞克隆、N基因原核表達(dá)質(zhì)粒pETN構(gòu)建及鑒定

根據(jù)1.4測序結(jié)果，設(shè)計一對針對N基因的亞克隆引物，上游引物：5'CCGGAATTCATGGCAAG CAGTAAGGCA 3'（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'CCGCTCGAGTCAAAGTTCATTTTCAC C 3'（下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以pMD18-T-N陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化回收后的N基因及空載體質(zhì)粒pET-30a（+）用EcoRⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)膠回收試劑盒純化回收。T4DNA連接酶進(jìn)行連接，10 μL連接體系：10× T4DNA ligase buffer 1 μL，目的片段6 μL，pET-30a（+）2.5 μL，T4DNA ligase 0.5 μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑取單一菌落，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并用菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a-N。

1.6 N重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將測序正確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落至含有Kan+LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；按照1∶100比例轉(zhuǎn)接于新含有Kan+LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4～0.6，加入終濃度1 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。37℃誘導(dǎo)6 h后收集菌體沉淀，超聲波裂解破碎細(xì)菌后，收集上清，沉淀用PBS懸起，按1∶1加2×上樣Buffer煮沸10 min，用12%SDSPAGE進(jìn)行電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色15 min后脫色觀察電泳結(jié)果。將另一塊SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用IBV全病毒多抗（1∶800）為一抗，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶800）為二抗進(jìn)行Western-blot分析，鑒定表達(dá)產(chǎn)物及其免疫原性。

1.7 重組蛋白的純化

重組蛋白的純化按照Ni-NTA試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行，將表達(dá)的菌體離心，沉淀用Lysis Buffer懸起，超聲波裂解后，12 000 r·min-1離心3 min，收集上清。將上清與已經(jīng)平衡的Ni離子純化樹脂在4℃充分結(jié)合2～3 h，然后分別用Washing buffer和Elution buffer洗脫液分步洗脫，收集各步洗脫液，測定蛋白濃度同時進(jìn)行SDS-PAGE分析目的蛋白的純化效果。

1.8 間接ELISA檢測方法的初步建立

1.8.1 抗原包被濃度及血清稀釋度的確定

將純化后的N蛋白作為診斷抗原，用包被液（0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）將診斷抗原分別稀釋至40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL-1，每孔100 μL包被酶標(biāo)板，4℃過夜。固定封閉液濃度及時間，IBV陽性血清和陰性血清用PBS分別稀釋至1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，固定血清作用時間、二抗?jié)舛燃皶r間、顯色時間。常規(guī)ELISA方法進(jìn)行多孔測定，結(jié)果取平均值并計算P/N值，確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.8.2 封閉試劑的選擇

在確定最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的基礎(chǔ)上，分別用5%脫脂乳、1%BSA、3%BSA和5%BSA作為封閉液，200 μL·孔-1，37℃封閉2 h。同時設(shè)立兩個復(fù)孔，測定OD490值，并分析P/N值變化情況。

1.8.3 一抗孵育時間的確定

根據(jù)以上篩選條件，固定抗原包被濃度、血清稀釋度、封閉液濃度、二抗稀釋度及時間、顯色時間設(shè)定血清作用時間分別為0.5、1、1.5、2 h。同時設(shè)立2個復(fù)孔，常規(guī)ELISA方法測定P、N值，計算P/N值，確定血清最佳作用時間。

1.8.4 二抗最佳稀釋度的選擇

將二抗按1∶500、1∶800、1∶1 000、1∶2 000稀釋，其他條件為優(yōu)化條件，同時設(shè)立兩個復(fù)孔，測定P、N值，根據(jù)P/N值確定二抗最佳稀釋度。

1.8.5 二抗作用時間的確定

根據(jù)選擇的最佳條件，固定顯色時間，將二抗作用時間分別設(shè)為0.5、1、1.5、2 h。同時設(shè)立兩個復(fù)孔，測定OD490值，根據(jù)P/N值確定二抗最佳作用時間。

1.8.6 最佳底物顯色時間的確定

根據(jù)篩選條件，將底物顯色時間設(shè)為5、10、15、20 min。同時設(shè)立兩個復(fù)孔，測定P、N值，并計算P/N值，確定底物顯色最佳時間。

1.8.7臨界值的確定

隨機(jī)抽取96份SPF陰性血清，按上述確定間接ELISA方法檢測，計算96份SPF雞血清的OD490平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），陰陽性臨界值的判斷方法為：臨界值=+3SD。當(dāng)待檢樣本OD490值≥+3SD時，在99.9%水平上判定為陽性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

1.9.1 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

用同一批制備的蛋白包被酶標(biāo)板，隨機(jī)取30份血清，每份血清做3個重復(fù)，在同一條件下按照間接ELISA的程序進(jìn)行檢測，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9.2 板間重復(fù)性試驗(yàn)

用同批次制備的蛋白包被3塊酶標(biāo)板，控制相同反應(yīng)條件，3塊酶標(biāo)板分別檢測30份不同血清樣本，在同一條件下按照間接ELISA的程序進(jìn)行檢測，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9.3 特異性試驗(yàn)

按上述間接ELISA操作流程，在同一條件下對禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒、大腸桿菌、沙門氏菌的陽性血清進(jìn)行測定，以IBV陽性和陰性血清作為對照，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，檢測該間接ELISA方法是否存在交叉反應(yīng)。

1.9.4 敏感性試驗(yàn)

將IBV陽性血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700倍比稀釋，每個稀釋度做3個重復(fù)，用建立的間接ELISA方法測定其OD490值。

1.9.5 臨床樣品的檢測

應(yīng)用建立的間接ELISA方法，對雞場采集的血清進(jìn)行檢測，檢測是否存在IBV抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD18-T-N重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ單酶切鑒定，可酶切約4 442 bp的片段；經(jīng)EcoRⅠ、PstⅠ雙酶切鑒定，可酶切約1750bp的目的片段和pMD18-T載體片段，表明目的片段已插入pMD18-T載體，與預(yù)期相符（見圖1A）。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-N經(jīng)EcoRⅠ單酶切鑒定和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，單酶切大小約為6 650 bp；雙酶切可酶切約1 230 bpN基因和5 422 bp pET-30a（+）載體片段，與預(yù)期結(jié)果相同。表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-N構(gòu)建成功（見圖1B）。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid by restriction endonucleases digestion

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pET-30a-N轉(zhuǎn)入表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單個菌落加入液體LB培養(yǎng)基，PCR鑒定的陽性菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取0～6 h菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在51 ku位置出現(xiàn)明顯條帶，而對照組在相應(yīng)位置沒有條帶表達(dá)（見圖2）。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，超聲處理后將上清、沉淀進(jìn)行12%電泳分析，從圖中可以看出此條帶出現(xiàn)在上清中，說明蛋白是以可溶形式存在。

圖2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed N protein

2.4 表達(dá)產(chǎn)物Western-blot鑒定

表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后，用IBV全病毒多抗對N融合蛋白進(jìn)行Western-blot檢測。N融合蛋白可與相應(yīng)IBV全病毒多抗發(fā)生特異性反應(yīng)（見圖3）。

圖3 重組蛋白的Western-blot鑒定Fig.3 Western-blot of the recombinant protein

2.5 重組蛋白的純化

重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，可獲得單一目的條帶，效果較好（見圖4）。

2.6 間接ELISA方法的建立

2.6.1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

由表1的數(shù)據(jù)分析，抗原的最佳包被濃度為2.5 μg·mL-1，血清的最佳稀釋度為1∶40，此時的OD490接近于1.0，且P/N值最大，結(jié)果見表1。

圖4 重組蛋白的純化Fig.4 Purification of recombinant protein

表1 血清稀釋倍數(shù)與抗原包被濃度的確定Table 1 Optimization of serum concentration and antigen coating concentration (μg·mL-1)

2.6.2 最佳封閉液的選擇及封閉時間的確定

由圖5（A）的數(shù)據(jù)可以看出，1%BSA作為封閉液時P值接近于1，P/N值最大，所以最佳封閉液為1%BSA。由圖5（B）可知，當(dāng)封閉時間為120 min時，P值接近于1，P/N值最大，所以最佳封閉時間為120 min。

2.6.3 最佳血清作用時間的確定

由圖5（C）的數(shù)據(jù)可知，當(dāng)血清作用1 h時，P值接近于1，且P/N值最大，所以最佳血清作用時間為1 h。

2.6.4最佳二抗工作濃度及二抗作用時間的確定

由圖5（D）的數(shù)據(jù)分析可以看出，二抗的工作濃度為1∶1 000時，P值接近于1，P/N值最大，所以最后選擇1∶1 000為最佳二抗稀釋度。由圖5（E）可知，當(dāng)二抗作用時間為1 h時，OD490值接近于1，P/N值最大，故二抗最佳作用時間為1 h。

2.6.5 最佳底物作用時間的確定

根據(jù)以上試驗(yàn)確定的條件，當(dāng)?shù)孜镲@色時間為10 min時，P值接近于1，且P/N最大。因此最佳底物顯色時間為10 min，結(jié)果見圖5（F）。

圖5 最佳優(yōu)化條件的確定Fig.5 Determination for optimal conditions of this ELISA

2.6.6 臨界值確定

取96份SPF雞陰性血清進(jìn)行OD490值的測定，根據(jù)計算，96份陰性血清的OD490平均值為0.180，標(biāo)準(zhǔn)差為0.016，根據(jù)臨界值的計算方法，臨界值= 0.180+3×0.016=0.2 286。由此，當(dāng)樣品的OD490值≥0.2286時，可在99.9%可信度上判定為陽性，否則為陰性。

2.6.7 重復(fù)性試驗(yàn)

30份血清的板內(nèi)CV最小值為0.6%，最大值為6.5%；板間CV最小值為1.6%，最大值為12.3%，均小于15%，表明建立的間接ELISA檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.6.8 特異性試驗(yàn)

將禽白血病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、沙門氏菌的陽性血清和IBV陽性血清、陰性血清通過試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測方法作對比，通過數(shù)據(jù)分析顯示，禽白血病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、沙門氏菌的陽性血清OD490值均小于判定IBV陽性臨界值0.2 286，與IBV陽性血清均無交叉反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性（見圖6）。

2.6.9 敏感性試驗(yàn)

將IBV陽性血清作8個梯度稀釋，用已建立的間接ELISA方法測定OD490值，由表2可知，當(dāng)陽性血清1∶500倍稀釋時，其結(jié)果為陽性，表明該方法具有良好的敏感性（見表2）。

圖6 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Result of specificity test of other avian viruses

表2 間接ELISA的敏感性試驗(yàn)Table 2 Results of sensitivity test

2.6.10 臨床樣本的檢測

應(yīng)用所建立的間接ELISA方法對兩個雞場的血清樣本進(jìn)行IBV抗體檢測，雞場1共75份蛋雞血清樣本，71份為陽性，陽性率為94.7%，OD490值在0.351～1.738，與病毒作為包被抗原ELISA檢測的符合率為94.7%；雞場2共60份肉雞血清樣本，50份為陽性，陽性率為83.3%，OD490值在0.347～1.684，與病毒作為包被抗原ELISA檢測的符合率為84.7%（見表3）。結(jié)果表明，兩個雞場經(jīng)過三次IB疫苗免疫后，均產(chǎn)生較高的IBV抗體水平。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of clinical test

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)將IBV HH06株的N基因片段成功克隆，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)N基因，SDSPAGE電泳結(jié)果證實(shí)N基因表達(dá)，且為可溶性表達(dá)，重組蛋白與IBV全病毒多抗發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性，為建立IBV抗體檢測方法奠定基礎(chǔ)。

根據(jù)IBV的HH06株的氨基酸序列可知，N蛋白的相對分子質(zhì)量約為45 ku，pET-30a（+）載體本身融合蛋白大小約為6 ku，因此表達(dá)的蛋白實(shí)際分子質(zhì)量約為51 ku。本試驗(yàn)在進(jìn)行SDS-PAGE時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩條帶，其中一條約為51 ku，與預(yù)期大小一致，另一條帶分子質(zhì)量約為47 ku，Western-blot也出現(xiàn)相同結(jié)果。在IBV[6-8]、火雞冠狀病毒[9]等已有報道，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似，故認(rèn)為47 ku的蛋白可能是51 ku蛋白裂解產(chǎn)物。

N基因在遺傳進(jìn)化中最為保守，將本研究中測序后N基因核苷酸和氨基酸序列（GenBank：KC256943.1）在NCBI上與其他IBV代表毒株（包括典型呼吸型和腎病變型毒株）進(jìn)行比對，核苷酸同源性高達(dá)88%以上，氨基酸同源性高達(dá)91%以上，也證明IBV N蛋白遺傳穩(wěn)定性。N蛋白在病毒復(fù)制過程中表達(dá)量高，刺激機(jī)體產(chǎn)生的ELISA抗體出現(xiàn)最早，效價最高[5]，在病毒組裝和機(jī)體細(xì)胞免疫等方面有重要作用，所以N蛋白是一種良好的診斷抗原，可用于IBV抗體檢測。

ELISA方法檢測IBV抗體與其他血清學(xué)診斷方法相比有靈敏度高、速度快、安全便捷，在短時間內(nèi)可檢測大量樣品、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，適于實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷及大規(guī)模疫病普查。Chen等將N基因在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，純化N蛋白作為包被抗原建立ELISA方法檢測IBV抗體。由于沒有病毒粒子，提高檢測安全性[10]。郝春麗利用純化后的可溶性的N蛋白建立間接ELISA方法，利用其建立的ELISA方法和商品化試劑盒檢測血清樣本，其陽性檢出率略低于商品化試劑盒，兩者符合率達(dá)85%[8]。本研究對N基因進(jìn)行原核表達(dá)，且重組蛋白為可溶性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)量高，純化較為方便，相較于真核表達(dá)系統(tǒng)省時省力。本試驗(yàn)以純化重組的蛋白作為包被抗原，初步建立IBV抗體的間接ELISA檢測方法，并對條件進(jìn)行優(yōu)化，可以對其他禽病原陽性血清進(jìn)行特異性鑒別診斷；檢測臨床樣品，平均陽性檢出率為89%，與病毒作為包被抗原ELISA檢測的平均符合率為89.7%，表明本試驗(yàn)獲得N蛋白可替代IBV病毒來檢測IBV抗體，具有良好的應(yīng)用價值，可作為臨床IBV快速診斷及免疫監(jiān)測的重要工具。

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Prokaryotic expression ofNgene of IBV HH06 strain and develop-ment of indirect IBV N protein-mediated ELISA

LI Guangxing1,WANG Xin1, PAN Long1,DU Weiwei1,HUANG Xiaodan2,SUN Gang3,YANG Guijun1,REN Xiaofeng1(1.School of Veterinary Medicines,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Polytechnic,Harbin 150080,China;3.Heilongjiang Veterinary Sanitation and Epidemic Prevention Station,Harbin 150090,China)

Avian infectious bronchitis(IB)is an acute and highly contagious disease which caused by infectious bronchitis virus(IBV).In the study,according to IBV gene sequences published in GenBank,specific primers were designed to cloneNgene by RT-PCR,and then this gene was inserted into pET-30a(+)vector resulting in a prokaryotic expression plasma pET-30a-N.The results of SDS-PAGE and Western-blot analysis showed that the recombinant protein was expressed successfully and had good reactivity with IBV positive serum.Using purified recombinant N protein as coating antigen,we established and optimized the indirect ELISA protocol,in which N protein was 2.5 μg·mL-1of concentration,sample serum of 1∶40 dilution.For clinical specimen,the IBV antibodies could be detected by this method efficiently,and got nearly the same results as those of IBV-mediated ELISA.It will provide a good tool for rapid diagnosis and epidemiological study of avian infectious bronchitis.

Q786；R526.2+1

A

1005-9369（2014）05-0075-08

李廣興,王新,潘龍,等.IBV HH06株N基因原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(5):75-82.

Li Guangxing,Wang Xin,Pan Long,et al.Prokaryotic expression ofNgene of IBV HH06 strain and development of indirect IBV N protein-mediated ELISA[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):75-82.(in Chinese with English abstract)

2013-12-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172295，31272569）

李廣興（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯游锊±韺W(xué)。E-mail:ligx@neau.edu.cn

時間2014-5-20 9:39:20[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140520.0939.001.html