蒼晶，姜曉娟，徐志超，林忠平，杜娟

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.北京大學蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點實驗室，北京 100871）

乙酰乙酰輔酶A還原酶基因phbB克隆及其表達初探

蒼晶1，姜曉娟1，徐志超2，林忠平2，杜娟2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.北京大學蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點實驗室，北京 100871）

從真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）中克隆得到PHB合成的關鍵酶基因，NADPH依賴性的乙酰乙酰輔酶A還原酶基因phbB（GenBank ID：KC191672），其DNA長度為741 bp，編碼246個氨基酸（aa），與GenBank數(shù)據(jù)庫中的entrophusPhbB（FJ897462.1）的同源性為70.99%。屬于膜蛋白或分泌蛋白，推測該蛋白可能定位在細胞膜上。成功構建原核表達載體pET28a（+）-phbB-HE。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測獲得phbB基因表達蛋白，其分子質(zhì)量為31 ku，為研究乙酰乙酰輔酶A還原酶活性及后期蛋白功能鑒定奠定基礎。

聚-β-羥基丁酸酯；重組表達；基因克??；純化；表達載體

塑料廢棄物造成的環(huán)境污染日益嚴重，日常生活和工業(yè)上廣為應用的塑料均是以石油為原料經(jīng)化學合成的石化產(chǎn)品。研制開發(fā)可降解塑料以減少環(huán)境污染具有重要意義[1-3]。自1962年以來，研究人員將目光投向聚-β-羥基丁酸酯（Poly-β-hydroxylbutyrate，PHB），它是一種理想的生物可降解塑料，以其良好的生物降解性和生物組織親合性受到關注，其分解產(chǎn)物在自然條件下可被一些微生物完全分解利用，對環(huán)境無任何污染，對人體無傷害[4]。雖應用前景廣闊，但因成本高于化工塑料而難以推廣[5-7]。隨著重組DNA技術的發(fā)展，為此轉基因植物生產(chǎn)生物可降解塑料開辟了新途徑。

PHB生物合成由3種性質(zhì)不同的酶共同催化：3-酮硫解酶、依賴NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶和PHB合酶，分別由phbA、phbB和phbC基因編碼。Poirier等在擬南芥細胞質(zhì)中定向合成PHB[8]；Nawrath等通過農(nóng)桿菌介導法對phbA、phbB和phbC基因進行修飾構建3個表達載體，通過雜交使3個關鍵酶基因共轉化在同一株擬南芥中成功表達[9]；Houmei等從堿桿菌分離得到3個編碼PHB關鍵酶基因（phbA、phbB和phbC），用種子特異啟動子代替35S啟動子，在油菜種子中成功表達[10]。在馬鈴薯、甜菜等植物中相應獲得成功[11-14]。

本文以真氧產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）為材料獲得PHB生物合成關鍵酶基因phbB，并構建原核表達系統(tǒng)。實現(xiàn)PHB合成基因在大腸桿菌中的表達以及PHB積累。為研究乙酰乙酰CoA還原酶的生化特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

原核表達載體pET28a、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由本實驗室保存；真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）由中國科學院微生物所提供；pMD18-T載體購自TaKaRa公司（大連）。

1.2 試劑與設備

質(zhì)粒純化試劑盒、T4DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ、pMD18-T載體購自TaKaRa公司（日本）；N，N'-亞甲雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250丙烯酰胺由北京拜爾迪生物技術有限公司提供；引物合成及測序由上海生工生物有限公司完成；臺式冷凍離心機均為Thermo公司產(chǎn)品；金屬浴與PCR儀為Eppendorf生產(chǎn)。

1.3 phbB基因的克隆及測序

采用優(yōu)化的CATB裂解法提取真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組DNA[15]，根據(jù)Alcaligenes eutrophusPhbB（FJ897462.1）基因編碼區(qū)（CDs）設計特異引物F：5'ATGACTCAGCGCATTGCGTATGTGACC 3'，R：5'TCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAG 3'。取2 μL DNA作為模板，PCR反應擴增條件：95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min 30 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。將回收產(chǎn)物連接在pMD18-T載體上，16℃連接過夜，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，涂布于含Kan+的LB固體平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性菌株送至上海生工生物公司測序。

1.4 原核表達載體構建

在引物兩端引入HindⅢ/EcoRⅠ酶切位點：F：5'CCCAAGCTTTCAGCCCATATG 3'，R：5'CC GGAATTCATGACTCAGCGC 3'。目的片段與pMD18-T載體連接后構建pMD18T-phbB質(zhì)粒，轉化工程菌E.coliDH5α。將純化的pMD18T-phbB質(zhì)粒和空的pET28a質(zhì)粒分別由HindⅢ/EcoRⅠ37℃雙酶切3 h左右，得到帶有相同粘性末端的pET28a和目的基因片段，回收的大小片段用T4DNA連接酶16℃下連接過夜，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 phbB基因蛋白在E.coli的誘導表達

挑取正確的重組質(zhì)粒和陰性對照空載體以1:50比例，加入含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)2～3 h至OD值達0.6～0.8，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol·L-1）分別在不同溫度30和16℃下誘導6和24 h，10 000 r·min-1離心1 min，沉淀樣品用200 μL冰預冷的磷酸緩沖液（PBS）懸浮，10 000 r·min-1離心1 min，棄上清。加入30 μL PBS和10 μL 4×SDS上樣緩沖液，劇烈振蕩，沸水浴中保持5 min，立即冰浴冷卻，12 000 r·min-1離心1 min，加入200 μL 1×SDS PAGE Loading buffer，15% SDS-PAGE檢測參照Schagger等方法[16]。

2 結果與分析

2.1 phbB基因片段的克隆及序列分析

以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）DNA為模板，擴增得到一條約750 bp的DNA片段且條帶清晰（見圖1）。通過NCBI上的軟件ORF Finder（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）分析，phbB基因全長為741 bp，編碼246個氨基酸（aa），與GenBank上收錄的eutrophus phbB（FJ897462.1）序列比對同源性達70.99%（見圖2），多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明該基因?qū)儆贜ADB-Rossmann超家族。并在GenBank數(shù)據(jù)庫進行登陸，登錄號為：KC191672。

圖1 PCR擴增的phbB基因序列Fig.1phbB gene sequence using PCR method

圖2 phbB基因與eutrophus phbB核酸序列比對Fig.2 Comparison among phbB gene sequence and eutrophus phbB

2.2 編碼蛋白信號肽和亞細胞定位分析

SignalP軟件對phbB基因編碼蛋白進行信號肽預測該蛋白屬于膜蛋白或分泌蛋白，在N-末端具有指導蛋白質(zhì)跨膜轉移（定位）的信號肽（見圖3）。PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）對phbB編碼的蛋白進行亞細胞定位，其中定位于質(zhì)膜和外部空間的平均分值分別為0.64和0.428（見圖4），從而推斷該蛋白可能定位在細胞膜上。

2.3 phbB蛋白三級結構預測

為更進一步了解phbB蛋白的特征，使用SWISS-MODEL方法，得到phbB蛋白的三維模型（見圖5A），它以N端一個α-螺旋開始，這個α-螺旋可能含有胞內(nèi)的定位信號。該蛋白含有＞45%的α折疊，＜5%的β折疊，和＞30%α/β折疊。其等電點（pI）為7.79，N末端下游211～232氨基酸處有一個強信號的跨膜螺旋。該蛋白的晶體結構（見圖5B）顯示一個與氧化還原酶作用的β片層形式堆疊結構，在N末端含有能夠與ND(P)H結合的TGxxxGxG結構，和一個輔助因子TGXXGXXG。這可能是phbB基因表達的乙酰乙酰CoA還原酶的活性中心。

圖3 phbB編碼蛋白信號肽預測Fig.3Signal peptide prediction of phbB protein

圖4 蛋白的亞細胞定位預測Fig.4 Subcellular localization prediction of protein

圖5 三維結構和晶體結構預測Fig.5 Three-dimensional structure and crystal structure prediction

2.4 pET28a（+）-phbB-HE質(zhì)粒構建和分析

以T7作為啟動子，選擇HindⅢ和EcoRⅠ為酶切位點設計特異性引物。經(jīng)DNA測序，證明兩個酶切位點已成功引入該片段（見圖6A）。將已得到phbB基因連接到經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pET-28a載體（見圖7），轉化至E.coliBL21（DE3）。PCR檢測結果顯示質(zhì)粒pET28a（+）-phbB-HE已完全轉入E.coliBL21（DE3）（見圖5）。最終通過對陽性克隆的測序，證明phbB基因已正確連接到pET32a（+）表達載體上，并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變，即質(zhì)粒pET28a（+）-phbB-HE構建與連接成功（見圖6B）。

圖6 PhbB基因序列（A）和重組質(zhì)粒pET28a(+)-phbB-HE構建圖Fig.6 PhbB gene sequence(A)and construction of recombinant plasmid pET28a(+)-phbB-HE(B)

圖7 重組質(zhì)粒pET28a(+)-phbB-HE的酶切鑒定Fig.7 Enzyme identification of recombinant plasmid pET28a(+)-phbB-HE

2.5 phbB基因表達蛋白在E.coli的誘導表達

含重組表達質(zhì)粒pET28a（+）-phbB-HE的工程菌E.coliBL21（DE3）在含Kan+的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD值達0.6～0.8。經(jīng)0.5 mmol·L-1IPTG誘導后，在37℃培養(yǎng)12 h后，分別對IPTG誘導前后的菌體和上清液處理。

經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示，與誘導前對照樣品比較，該工程菌株誘導后的樣品在約31 ku處條帶明顯（見圖9），其分子質(zhì)量和理論值吻合，而在陰性對照組中無任何表達，說明成功表達phbB基因蛋白。另外，使用（終濃度為0.5 mmol·L-1）IPTG對含pET28a（+）-phbB-HE重組質(zhì)粒的E.coliBL21（DE3）菌株進行不同條件下處理，并選出最佳誘導條件為30℃/6 h。

圖8 質(zhì)粒pET28a（+）-phbB-HE轉入E.coli BL21（DE3）結果Fig.8 Plasmid pET28a(+)-phbB-HE transformed into E.coli BL21(DE3)result

圖9 重組質(zhì)粒在E.coli BL21（DE3）表達蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.9 SDS-PAGE analysis for proteins expressed in E.coli BL21(DE3)

3 討論與結論

PHB是一種自然界中存在的可降解性高分子聚合物，由其合成途徑可知，兩個乙酰輔酶A分子在β-酮硫解酶作用下縮合成乙酰乙酰輔酶A，在乙酰乙酰輔酶A還原酶作用下生成β-羥丁酰輔酶A，最后經(jīng)PHB合成酶合成聚-β-羥基丁酸。因此，編碼β-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶及PHB合成酶的基因phbA、phbB和phbC在PHB生物合成途徑起到至關重要作用[17-18]。本文以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）DNA為模板，參考GenBank上收錄的eutrophus phbB（FJ897462.1）全長DNA序列，成功克隆獲得編碼乙酰乙酰輔酶A還原酶的phbB基因序列，同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析表明該基因?qū)儆贜ADB-Rossmann超家族。該研究為最終實現(xiàn)商品化生產(chǎn)PHB提供可能。但該基因的表達蛋白乙酰乙酰輔酶A還原酶的生物學活性及其導入植物反應器后對聚-β-羥基丁酸酯（PHB）合成的調(diào)控作用，有待進一步研究。

為驗證該基因功能，本文選擇pET28a（+）作為表達質(zhì)粒，它所攜帶的T7啟動子是一種專一性很強的啟動子，完全受控于T7RNA聚合酶。大腸桿菌作為外源性基因表達的宿主菌，是獲得大量重組蛋白較為理想的表達系統(tǒng)[19-21]。其本身不含T7RNA聚合酶，在IPTG誘導下，溶源菌體內(nèi)的lacUV5啟動子解阻遏，生成T7RNA多聚酶能快速轉錄外源基因，在一定情況下可大量表達相應的靶蛋白，高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍。因此，通過控制誘導條件控制T7RNA聚合酶量，可實現(xiàn)調(diào)控phbB基因在大腸桿菌中的產(chǎn)物表達量。在本試驗條件下，篩選出最佳誘導條件為30℃/6 h，但此條件下的phbB蛋白表達量并未達到理想水平，仍有待對誘導條件和菌株作進一步的摸索和純化，為最終實現(xiàn)商品化生產(chǎn)PHB奠定基礎。

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CANGJing1,JIANGXiaojuan1,XUZhichao2,LIN Zhongping2,DU Juan2(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China;2.National Laboratory of Protein Engineering and Plant Genetic Engineering,Peking University,Beijing 100871,China)

The full-length cDNA sequence of NADPH-dependent acetyl-CoA enzyme reductase gene namedphbB(GenBank ID:KC191672)as the key enzymes of PHB synthase gene were cloned fromAlcaligenes faecalis(Alcaligenes eutrophus).According toentrophusPhbB(FJ897462.1)sequences that has been speculated.The gene homology was 70.99%,with the length of 740 bp encoded 246 aminoacids(aa).The recombinant plasmid named pET28a(+)-phbB-HE were constructed successfully.The products were identified by SDS-PAGE analysis,it confirmed that high efficiency expression of the phbB protein fragments(ca.31 ku)were demonstrated.It laid a solid foundation for further study of phbBgene activity and late protein identification.

poly-β-hydroxyl butyrate;recombinant expression;gene clone;purification;expression vector

Q785

A

1005-9369（2014）05-0037-07

2013-03-04

國家863計劃項目（2008AA05Z402）

蒼晶（1963-），女，教授，博士，博士生導師，研究方向為植物生理生化。E-mail:cangjing2003@163.com

時間2014-5-19 11:25:10[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140519.1125.004.html

蒼晶,姜曉娟,徐志超,等.乙酰乙酰輔酶A還原酶基因phbB克隆及其表達初探[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(5):37-43.

Cang Jing,Jiang Xiaojuan,Xu Zhichao,et al.Molecular cloning and primary expressed exploration of acetoacetyl-CoA reductase gene(phbB)[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):37-43.(in Chinese with English abstract)

Molecular cloning and primary expressed exploration of acetoacetyl- CoA reductase gene(phbB)