白靖文，陶波，楊昱

（1.東北農業(yè)大學理學院，哈爾濱 50030；2.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

發(fā)芽小麥除草活性物質超聲提取及生物活性研究

白靖文1，陶波2*，楊昱1

（1.東北農業(yè)大學理學院，哈爾濱 50030；2.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

為了提取抑制黃瓜萌發(fā)及生長的發(fā)芽小麥中的活性物質，采用L9（34）正交試驗設計，以黃瓜萌發(fā)抑制率為跟蹤手段，研究超聲時間、超聲功率、超聲溫度、液料比對發(fā)芽小麥活性物質提取的影響。結果表明，影響發(fā)芽小麥活性物質提取的主次因素為超聲溫度＞超聲時間＞液固比＞超聲功率；經正交試驗確定最佳提取條件為提取溫度50℃，超聲時間40 min，液固比20，超聲功率為400 W，經6次平行試驗驗證，該試驗穩(wěn)定可靠，與對照試驗相比，植物黃瓜萌發(fā)抑制率為63.64%?；钚晕镔|濃度為4 mg·mL-1時，對黃瓜生長存在不同程度抑制作用，株鮮重和根鮮重抑制作用最強。

發(fā)芽小麥；超聲輔助提??；黃瓜；萌發(fā)及生長；抑制作用

小麥產量和種植面積在全世界居于首位[1]，為保證小麥產量和品質，每年向麥田中施用大量農藥除草劑，對環(huán)境和食品安全產生危害[2]。利用小麥自身向環(huán)境中釋放植物次生代謝產物達到抑制雜草萌發(fā)及生長的異株克生作用（也稱化感作用）控制雜草，能達到施用農藥的效果又不引起環(huán)境變化[3]。具有經濟潛力和社會效益。小麥異株克生作用研究始于20世紀40年代[4]，Mccallah等報道小麥秸稈覆蓋對玉米的發(fā)芽和生長抑制作用[5]。后期研究表明，小麥還存在自毒作用[6-8]，對寬葉雜草具有較強抑制作用[9]，Hisashi等發(fā)現燕麥芽中存在抑制萵苣萌發(fā)及生長的除草活性物質[10]，Reberg-Horton等研究黑麥覆蓋抑制雜草[11-15]。Leather和Hiroshi等證實小麥對雜草發(fā)芽抑制程度因作物和雜草種類及環(huán)境條件不同有差別[16-18]，對野燕麥的發(fā)芽及幼苗生長存在明顯抑制作用[19]，野燕麥也會對小麥產生異株克生作用[20]。我國學者從1996年開始對小麥化感作用開始研究[21-26]，證實小麥對繁縷、千金子、白茅及水稻具有強烈抑制作用。目前，對小麥生長過程中的根、莖、葉等各組織部分或器官的異株克生作用均有研究報道[27]，而對發(fā)芽小麥發(fā)芽種子異株克生作用研究還鮮有報道。Naumov等最早對種子萌發(fā)釋放的活性物質進行研究[28]。國內有Bai等對發(fā)芽小麥種子釋放活性物質進行研究，發(fā)現發(fā)芽小麥提取物對黃瓜種子萌發(fā)及生長具有抑制作用[29-30]。

異株克生活性物質在小麥種子中含量極低，影響活性物質種類和結構鑒定，制約小麥種子異株克生作用。本文采用超聲波輔助法提取發(fā)芽小麥種子活性物質，利用超聲波打碎小麥種子細胞壁，提高活性物質溶出率[31]，對提取物進行生物活性測定，確定異株克生物質對指示植物生長發(fā)育過程產生抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：龍輻18小麥種子（黑龍江省農科院贈送），春心常綠黃瓜種子（購自哈爾濱公濱種子商店）。

試劑：無水乙醇（分析純）。

1.2 儀器與設備

分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；R-205旋轉蒸發(fā)儀（山海申勝生物技術有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZK-82A型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器有限公司）。

1.3 試驗流程

小麥種子→培養(yǎng)箱發(fā)芽→干燥→超聲提取→旋轉蒸發(fā)→溶解定容→抑制率試驗→生長指標測定。

1.4 方法

1.4.1 小麥種子活性物質超聲輔助提取

根據預實驗結果從40個種小麥品種中選取化感抑制活性較高的龍輻18小麥種子為供試材料，從17個雜草與蔬菜品種中選取敏感黃瓜種子為指示植物。選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率、液料比等四個超聲輔助提取影響因素，進行正交試驗設計，根據提取物對指示植物萌發(fā)抑制率選取最佳提取條件[12]。結果見表1。

表1 超聲提取法正交試驗設計表Table 1 Orthogonal factors and levels of ultrasonic extraction method

1.4.2 提取物對黃瓜種子萌發(fā)抑制率測定

采用培養(yǎng)皿濾紙法進行黃瓜種子發(fā)芽率測定。將超聲提取液蒸干，50 mL容量瓶蒸餾水定容，加入到鋪有兩層定性濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿均勻擺放飽滿的供試種子20粒，以蒸餾水為對照，每份設置3個重復。置于人工智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，依照公式（1）計算黃瓜萌發(fā)抑制率。1.4.3提取物對黃瓜各項生理指標的抑制作用測定

株高、根長、株鮮重、根鮮重、株干重、根干重各項生理指標測定采用砂培法。具體為每個杯子中放6粒發(fā)芽黃瓜種子，設置3次重復。每個杯子倒入60 mL提取物溶液，對照杯中則加入60 mL蒸餾水。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用水沖掉黃瓜植株表面沾附沙子，濾紙吸干植株表面吸附水分，依次測量種子的株高、根長，株鮮重、根鮮重、株干重及根干重，記錄數據，據1.4.2抑制率公式計算分析結果。

2 結果與分析

2.1 發(fā)芽小麥超聲波輔助提取試驗結果

結果見圖1。

圖1 超聲提取條件對黃瓜種子萌發(fā)抑制率影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction condition on the inhibition rate of cucumber seed germination

如圖1所示，超聲溫度、液固比、超聲時間和超聲功率四個超聲提取影響因素對指示植物種子萌發(fā)均產生影響，根據試驗結果確定各因素最佳條件分別為：超聲提取溫度50℃，液固比20，超聲時間30 min，超聲功率300 W，通過SPSS軟件進行四因素三水平正交設計。結果見表2～3。

由表2～3可知，RA＞RC＞RB＞RD，各因素對黃瓜種子的抑制率的影響程度依次為：超聲溫度＞超聲時間＞液固比＞超聲功率，溫度對黃瓜種子的抑制率影響最為顯著，優(yōu)化得到超聲提取小麥種子的最佳條件為：A2B2C3D3，即提取溫度為50℃，超聲時間為40 min，液固比為20，超聲功率為400 W。由于該試驗條件不在試驗設計范圍內，故需做驗證試驗。

2.2 平行對照試驗

按2.1得到的最佳超聲提取條件，提取溫度為50℃，超聲時間為40 min，液固比為20，超聲功率為400 W。進行6次發(fā)芽小麥種子的超聲提取驗證試驗，得到提取物生測抑制率分別為63.87%、63.89%、62.71%、63.18%、65.04%、62.15%，均值為63.64%，RSD為1.17%，表明所選的最優(yōu)工藝條件結果理想，試驗條件下所得工藝參數穩(wěn)定可靠。相同提取條件下，進行未超聲輔助提取的對照試驗，對黃瓜萌發(fā)抑制率只有41.29%。與對照試驗相比，超聲輔助提取最優(yōu)工藝將黃瓜萌發(fā)抑制率提高22.35%。根據最佳試驗條件對發(fā)芽小麥化感作用物質進行提取，提取物進行化感生物活性測定。

2.3 不同濃度提取物對黃瓜生長活性的影響

結果見圖2。

如圖2所示，不同濃度提取物對黃瓜株高生長影響不同，在高濃度時產生抑制作用，在低濃度時發(fā)生促進作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈現變大的趨勢。在濃度為4 mg·mL-1時，株高抑制率為28.58%，表明在活性物質高濃度時抑制了黃瓜植株生長，株高變矮，但作用效果不強。

表2 超聲提取法正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of ultrasonic extraction method

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖2 水溶劑提取物對黃瓜株高影響Fig.2 Effect of active substances from water solvent extraction on the height of cucumber

如圖3所示，水溶劑提取物在不同濃度時對黃瓜株重均產生抑制作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈上升趨勢。在濃度為4 mg·mL-1時，株重抑制率為78.01%。表明發(fā)芽小麥水溶劑提取物能顯著抑制黃瓜植株含水量。

如圖4所示，水溶劑提取物在不同濃度時對黃瓜株干重均產生抑制作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈上升趨勢。在濃度為4 mg·mL-1時，株干重抑制率為41.84%。表明發(fā)芽小麥水溶劑提取物能抑制黃瓜植株干物質含量。

如圖5所示，水溶劑提取物在不同濃度時對黃瓜根長均產生抑制作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈上升趨勢。在濃度為4 mg·mL-1時，根長生長抑制率為50.73%。表明發(fā)芽小麥水溶劑提取物能抑制黃瓜植株根生長伸長。

圖3 水溶劑提取物對黃瓜株鮮重的抑制率Fig.3 Inhibition rate of active substances of aqueous extract on the cucumber fresh weight

圖4 水溶劑提取物對黃瓜株干重的抑制率Fig.4 Inhibition rate of active substances of aqueous extract on the cucumber dry weight

圖5 水溶劑提取物對黃瓜根長的抑制率Fig.5 Inhibition rate of active substances of aqueous extract on the cucumber root length

如圖6所示，水溶劑提取物在不同濃度時對黃瓜根鮮重均產生抑制作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈上升趨勢。在濃度為4 mg·mL-1時，根鮮重抑制率為89.36%。表明發(fā)芽小麥水溶劑提取物能顯著抑制黃瓜植株根含水量。

如圖7所示，水溶劑提取物在不同濃度時對黃瓜根干重均產生抑制作用，隨著活性物質濃度升高，抑制呈上升趨勢，且高濃度抑制率相比低濃度時抑制率增加明顯。在濃度為4 mg·mL-1時，根干重抑制率為44.39%。表明發(fā)芽小麥水溶劑提取物能抑制黃瓜植株根中干物質含量。

圖6 水溶劑提取物對黃瓜根重的抑制率Fig.6 Inhibition rate of active substances of aqueous extract on the cucumber root weight

圖7 水溶劑提取物對黃瓜根干重的抑制率Fig.7 Inhibition rate of active substances of aqueous extract on the cucumber root dry weight

從表4可以看出，在不同濃度條件下發(fā)芽小麥提取物對黃瓜根長、株鮮重、根鮮重、株干重、根干重均表現抑制作用，活性物質濃度為0.25和0.50 mg·mL-1時，對黃瓜的株高出現促進作用。在0.25 mg·mL-1濃度時，對黃瓜根鮮重和株鮮重的抑制作用影響顯著，其他濃度對黃瓜生長影響差異均不顯著。在活性物質濃度為4.0 mg·mL-1時，對黃瓜各項指標抑制效果最大。

表4 不同濃度活性物質對黃瓜生長影響Table 4 Different concentrations of active substances influence on the growth of cucumber

3 討論與結論

試驗研究因素對黃瓜萌發(fā)抑制率影響次序為超聲溫度＞超聲時間＞液固比＞超聲功率。以黃瓜萌發(fā)抑制率為指標，獲得小麥發(fā)芽種子提取的最佳條件：提取溫度為50℃，超聲時間為40 min，液固比為20，超聲功率為400 W。經6次平行試驗驗證，試驗穩(wěn)定可靠。在最佳提取條件下，與對照試驗比較，黃瓜萌發(fā)抑制率提高22.35%。與一般傳統(tǒng)提取方法相比，超聲輔助提取法具有提取率較高、提取速度快、效率高、能耗低、后續(xù)處理簡單等優(yōu)點，適合發(fā)芽小麥抑制萌發(fā)活性物質提取。本試驗建立的超聲輔助提取模型可為發(fā)芽小麥活性物質及其他植物中活性物質提取提供理論參考，但提取到發(fā)芽小麥活性物質仍為混合物，下一步還需進行分離鑒定試驗，確定發(fā)芽小麥釋放活性物質種類及結構。

本試驗研究發(fā)芽小麥提取物對指示植物的根長、根鮮重、根干重、株高、株鮮重、株干重等生物活性測定，發(fā)現發(fā)芽小麥能顯著抑制黃瓜種子萌發(fā)及根長、根鮮重等生物活性，且抑制程度與發(fā)芽小麥提取物濃度正相關。這與Perez等研究小麥秸稈腐解產生活性物質對野燕麥根長及萌發(fā)抑制作用結果一致[21,32]。小麥秸稈水提液對裂葉牽牛、小絨毛草等植物具有抑制作用，且抑制能力依次減弱，研究發(fā)現小麥對寬葉雜草具有較強的抑制作用[33]。李善林等研究發(fā)現抽穗期小麥提取物對反枝莧的抑制率達到82%，用同劑量的提取物處理繁縷的莖葉，30d后76%～85%的繁縷死亡[22]。張曉珂等研究東北地區(qū)不同小麥品種對黑麥草根長、苗高、根干重及苗干重的影響，其中四個小麥品系對黑麥草抑制作用較強[1]。Oueslati等研究表明許多小麥對不同指示植物都具有異株克生潛力，并根據不同指示作物成功篩選出異株克生潛力大品種[27]。Mitsunori等研究表明，對種子萌發(fā)抑制作用受到多種植物激素調控[34]。Sangmin等對擬南芥、玉米和大麥等研究表明，SA影響種子萌發(fā)具有濃度依賴效應[35]。

脅迫條件下，SA在植物種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用，但其確切機制尚不明確，缺乏統(tǒng)一認識，甚至存在相互矛盾結論[36]，對小麥秸稈和根系分泌物產生抑制作用的研究很多，但缺少對發(fā)芽小麥抑制植物萌發(fā)及生長的研究，本試驗研究發(fā)芽小麥對黃瓜萌發(fā)及生長抑制作用，發(fā)現發(fā)芽小麥釋放活性物質顯著抑制黃瓜萌發(fā)及生長，但對黃瓜抑制作用機理研究仍不清楚，尚需深入研究。

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Research on the ultrasonic extraction and inhibiting activity of herbici- dal active substances of germinated wheat

BAI Jingwen1,TAO Bo2,YANG Yu1(1.School of Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Single factor test and L9(34)orthogonal design were used to study the extraction of the active substances inhibiting the germination and growth of cucumber from germinated wheat,and the effects of ultrasonic time,ultrasonic power,ultrasonic temperature and liquid-solid ratio were investigated by the tracking means of germination inhibition rate of cucumber.The results showed that the primary and secondary factors to impact the extraction of active substances from germinated wheat were as follows,ultrasonic temperature＞ultrasonic time＞liquid-solid ratio＞ultrasonic power.The optimum extraction conditions determined through orthogonal tests were extraction temperature 50℃,ultrasonic time 40 min,liquid-solid ratio 20,ultrasonic power 400 W,and the test was stable and reliable by six parallel tests verification,compared with the control experiments,cucumber germination inhibition rate was 63.64%.There were different degrees of inhibition on the growth of cucumber when the concentration of the active substance reached 4 mg·mL-1,and the inhibitory effect were the strongest on fresh weight and root fresh weight of cucumber.

germinated wheat;ultrasonic assisted extraction;cucumber;germination and growth; inhibition

S512.1

A

1005-9369（2014）05-0019-07

2014-04-02

黑龍江省教育廳科研項目（12531044）

白靖文（1978-），男，副教授，博士，研究方向為植物源農藥提取及作用機制。E-mail:baijingwen@neau.edu.cn

*通訊作者：陶波，教授，博士生導師，研究方向為農藥作用機理、農藥新活性物質的開發(fā)與應用。E-mail:botaol@163.com

時間2014-5-19 11:24:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140519.1124.002.html

白靖文,陶波,楊昱.發(fā)芽小麥除草活性物質超聲提取及生物活性研究[J].東北農業(yè)大學學報,2014,45(5):19-25.

Bai Jingwen,Tao Bo,Yang Yu.Research on the ultrasonic extraction and inhibiting activity of herbicidal active substances of germinated wheat[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):19-25.(in Chinese with English abstract)