李靜，劉旭東，陳文明，楊小艷，羅勇，②

（1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000 E-mail：lijing509＠163.com；2.遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.貴州航天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003）

紅花作為一種傳統(tǒng)的活血化瘀的代表性藥物，本草綱目記載有“活血、潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)”功效［1］。其提取物紅花注射液，目前被人們所廣泛認(rèn)可并主要用于治療冠心病、心絞痛、脈管炎等多種血液循環(huán)障礙疾病的治療［2］。但是關(guān)于紅花注射液通過抑制炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其保護(hù)作用的報(bào)道少見。本課題組研究，紅花注射液通過抑制局灶性腦卒中炎癥蛋白的表達(dá)。通過紅花注射液不同濃度對(duì)局灶性缺血性大鼠模型治療作用，觀察皮質(zhì)iNOS、COX-2的表達(dá)，從蛋白水平分析其作用機(jī)制，為紅花注射液在治療缺血性腦卒中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠，36只，雄性，體重（260±20）g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005。

1.2 藥物 紅花注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），尼莫地平注射液（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；iNOS（Lo：t 1106）和COX-2（Lo：t C0206）免疫組化試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB（武漢博士德生物工程有限公司），大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）栓線（北京沙東生物公司），Leica光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（德國Leica Microsystems Ltd）。中性樹膠（上海標(biāo)本模型廠）。

2 方法

2.1 模型制備 根據(jù)改進(jìn)的Zea Longa［3］方法，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，右頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，分別放置手術(shù)線備用。結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉處約4 mm 處剪一小口，將MCAO栓線圓頭端栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，以頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20 mm，感到阻力即到達(dá)了較細(xì)的大腦前動(dòng)脈內(nèi)，阻斷了大腦中動(dòng)脈的所有血供來源。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合（將栓線預(yù)留少許于體外）。栓塞2h后，固定大鼠，將栓線抽拉出至頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處。正常組和對(duì)照組不做任何處理，參照文獻(xiàn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分［2］，評(píng)分大于2分，入選。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 將36只健康的Wistar大鼠隨機(jī)分成6組：①正常給藥組；②模型對(duì)照組；③低劑量紅花組；④中劑量紅花組；⑤高劑量紅花組；⑥陽性藥（尼莫地平）組。每組6只。分組結(jié)束后開始給藥，每天3次；給藥2周后。制模24h后開始采用改良的Bedersons評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，評(píng)分大于2分入組。正常對(duì)照組6只，各實(shí)驗(yàn)組每組6只。正常對(duì)照組不予處理；紅花注射液不同濃度組（0.8 ml·kg-1·d-1、1.6ml·kg-1·d-1、3.2ml·kg-1·d-1）與模型組于模型成功后，24h后開始連續(xù)灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3d；正常對(duì)照組及模型組給予生理鹽水。

2.3 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元iNOS、COX-2表達(dá)的檢測(cè) 3d后將大鼠迅速處死取腦，固定，選取注射部位，修塊，再固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，采用免疫組化（PV 二步法）檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元iNOS、COX-2的表達(dá)，其中滴加一抗（iNOS為兔抗大鼠，COX-2 為山羊抗大鼠），一抗的稀釋比例（iNOS、COX-2為1∶100），陰性對(duì)照用PBS 代替一抗。光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元2項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化。每組大鼠腦組織切片5張，每張切片皮質(zhì)層分別隨機(jī)選取2個(gè)區(qū)域，觀察400倍顯微鏡下計(jì)算此區(qū)域內(nèi)的免疫組化染色的陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性目標(biāo)總面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅花注射液對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)iNOS蛋白表達(dá)的影響 正常對(duì)照組腦組織中iNOS蛋白未見表達(dá)，模型組iNOS蛋白明顯表達(dá)；與模型組比較，紅花注射液各劑量組和尼莫地平注射液組陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P ＜0.01），紅花注射液各組與尼莫地平注射液組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)iNOS的表達(dá) （±s，n ＝6）

表1 各組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)iNOS的表達(dá) （±s，n ＝6）

注：與模型組比較，a：t＝5.999，P ＜0.001，b：t＝6.989，P＜0.001，c：t＝5.949，P ＜0.001，d：t＝7.656，P ＜0.001

組別 劑量（ml·kg-1·d-1）陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）正常對(duì)照組1.6 0模型組0 103.0±8.01紅花注射液低劑量組0.8 74.6±6.92a紅花注射液中劑量組1.6 70.5±6.63b紅花注射液高劑量組3.2 69.8±9.57c尼莫地平注射液組2.0 69.6±5.67d

3.2 紅花注射液對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)COX-2蛋白表達(dá)的影響 正常對(duì)照組腦組織中COX-2蛋白見少量表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，模型組COX-2 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加；與模型組比較，紅花注射液各劑量組和尼莫地平注射液組陽性細(xì)胞數(shù)目減少（P ＜0.01），紅花注射液各組與尼莫地平注射液組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)COX-2的表達(dá) （±s，n ＝6）

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)COX-2的表達(dá) （±s，n ＝6）

注：與 正 常 對(duì)照組比 較，a：t ＝36.733，P ＜0.001，b：t＝23.382，P ＜0.001，c：t ＝21.515，P ＜0.001，d：t ＝23.563，P ＜0.001，e：t＝26.546；與模型組比較，f：t＝7.558，P＜0.001，g：t＝7.370，P ＜0.001，h：t＝8.842，P ＜0.001，i：t＝9.684，P ＜0.001

組別 劑量（ml·kg-1·d-1）陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）正常對(duì)照組1.6 11.4±2.71模型組0199.1±11.1a紅花注射液低劑量組0.8 143.1±12.3bf紅花注射液中劑量組1.6 142±13.3cg紅花注射液高劑量組3.2 135.9±11.5dh尼莫地平注射液組2.0 134.4±10ei

4 討論

腦缺血后，涉及到自由基的損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載、炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子的浸潤、凋亡基因激活、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用等多個(gè)方面。iNOS作為NO 的誘導(dǎo)型，在作用取決于腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)及不同細(xì)胞類型，發(fā)揮不同的作用。既往研究顯示iNOS在自身免疫性疾病或慢性炎癥過程及其它疾病中可能起有害的作用。一方面具有神經(jīng)介質(zhì)及擴(kuò)張血管的作用，另一方面神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠局灶性缺氧模型鼠，在大腦中動(dòng)脈供血皮質(zhì)區(qū)有iNOS的表達(dá)，這與任俊等［4］的研究結(jié)果一致。使用不同濃度的紅花注射液后，皮質(zhì)區(qū)iNOS的表達(dá)明顯下調(diào)，呈濃度依賴性，當(dāng)高劑量組（3.2 ml·kg-1·d-1）時(shí)，保護(hù)作用接近傳統(tǒng)尼莫地平陽性對(duì)照組。提示紅花注射液在減低iNOS的表達(dá)，存在一定的保護(hù)作用。COX-2是環(huán)氧化酶的誘生型，在正常組織內(nèi)的活性較低，僅在一些細(xì)胞（例如：神經(jīng)元）有低水平表達(dá)。在受到缺氧等刺激后表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠局灶性缺氧模型鼠，在大腦中動(dòng)脈供血皮質(zhì)區(qū)有COX-2 的表達(dá)，這與既往研究結(jié)果一致［5-6］。COX-2的毒性作用可能與活性氧和毒性PGS有關(guān)，通過產(chǎn)生大量的超氧化物或其介導(dǎo)引起炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞毒性，促進(jìn)血小板聚集、血栓形成，加重?fù)p傷［7-8］。在使用特異性抑制劑lumiracoxib后，能降低COX-2 依賴性的自由基毒性，從而改善中風(fēng)患者預(yù)后，并對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的治療作用。本研究顯示使用不同濃度的紅花注射液后，皮質(zhì)區(qū)COX-2 的表達(dá)明顯下調(diào)，呈濃度依賴性，當(dāng)給予高劑量（3.2ml·kg-1·d-1）時(shí)，保護(hù)作用接近傳統(tǒng)尼莫地平陽性對(duì)照組。提示紅花注射液在減低COX-2在海馬區(qū)的表達(dá)有一定的作用。不同濃度的紅花注射液在減輕炎癥反應(yīng)物iNOS、COX-2顯示一定的保護(hù)性，并呈濃度依賴性。但是兩者在缺血性腦卒中患者的保護(hù)作用及機(jī)制，需要更深入的研究。

［1］ 劉世清，吳飛，饒婷，等.單味黃芪紅花丹參注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的初步研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（14）：1470-1472.

［2］ 林濤.紅花注射液對(duì)冠心病患者冠脈血流、抗氧化能力及脂質(zhì)代謝的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（31）：3267-3269.

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