趙宗哲， 魯明明， 趙文明* ， 吳 超* ， 趙 穎， 郝艷娜

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，遼寧 錦州121001;2. 大連富生天然藥物開發(fā)有限公司，遼寧 大連116000)

人參皂苷Rg3 是從人參中提取出來的一種四環(huán)三萜類皂苷，對(duì)抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和浸潤，提高機(jī)體免疫力作用顯著［1］。人參皂苷Rg3 屬于BCS 二類藥物，水中的溶解度極低，但口服吸收迅速，因此體外溶出速度是其口服吸收的限速步驟［2］。文獻(xiàn)報(bào)道人參皂苷Rg3 口服后血漿濃度很低，3.2 mg/kg 口服后的Cmax值僅為(16 ±6)ng/mL［3］。無機(jī)多孔材料的發(fā)展為提高難溶性藥物水溶性提供了一個(gè)新思路，其解決藥物的難溶的原理是利用介孔孔道的高比表面積吸附難溶性藥物進(jìn)入介孔結(jié)構(gòu)，后者強(qiáng)大的空間效應(yīng)可抑制難溶性藥物的結(jié)晶度，使難溶性藥物以無定形或者微晶態(tài)分布在多孔材料的多孔網(wǎng)絡(luò)中，從而降低了藥物粒子的大小，增加了藥物的比表面積［4-5］。根據(jù)Ostwald-Freundlich 方程與Noyes-Whitney 方程，粒子大小的下降和比表面積的增加不僅能夠增加藥物的溶出速度，而且能促進(jìn)納米級(jí)藥物粒子與生物膜的接觸，有利于藥物的吸收［6-8］。為了解決人參皂苷Rg3 的難溶問題，本實(shí)驗(yàn)制備了人參皂苷Rg3-介孔二氧化硅納米粒(Rg3-MSN)固體分散體，旨在提高人參皂苷Rg3 的溶出速率，提高其口服生物利用度。

1 儀器與試劑

人參皂苷Rg3 (大連富生制藥有限公司，批號(hào)20120803，純度＞95%);十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正辛烷、L-賴氨酸、正硅酸乙酯(TEOS)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);苯乙烯(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(AIBA，青島柯信新材料科技有限公司);甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，HPLC 級(jí));十二烷基硫酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);真空干燥箱(DZF6050，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司);水浴振蕩器(HZS-H，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠);高效液相色譜儀(D-2000，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司);紅外光譜儀(IRAffinity-1，島津國際貿(mào)易(上海)有限公司);差示掃描量熱儀(DSC-60，日本島津公司);智能溶出試驗(yàn)儀(2RS-8，天津大學(xué)無線電廠);X 射線衍射儀(2500 PC，Rigaku Corporation);比表面積及孔徑分析儀(SA3100，Beckman Coulter)。

2 方法與結(jié)果

2.1 介孔二氧化硅納米粒的制備 0.1 g 的十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)置于三頸瓶中，加30 mL水，60 ℃水浴，攪拌溶解形成透明溶液，加入16 mL 的正辛烷，在攪拌下加入苯乙烯 (50 mg/mL)，22 mg 賴氨酸，1 mL TEOS 和AIBA(0.84 mg/mL)，體系呈乳白色，氮?dú)夥諊拢?0 ℃水浴3 h，過濾得到沉淀，50 ℃干燥得到實(shí)心顆粒，550 ℃煅燒去除模板，得到介孔二氧化硅納米粒［9］。由透射電鏡照片(圖1)可見納米粒呈現(xiàn)規(guī)則的球狀，直徑約為100 nm，內(nèi)部孔道呈放射狀，孔道均勻一致，孔徑約為10 nm (表1)。

圖1 介孔二氧化硅納米粒(MSN)透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM pictures of MSN

表1 MSN 和Rg3-MSN 固體分散體的結(jié)構(gòu)參數(shù)(±s，n=3)Tab.1 Textural properties of MSN and Rg3-MSN solid dispersion (±s，n=3)

表1 MSN 和Rg3-MSN 固體分散體的結(jié)構(gòu)參數(shù)(±s，n=3)Tab.1 Textural properties of MSN and Rg3-MSN solid dispersion (±s，n=3)

注:與MSN 相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

樣品 比表面積/(m2·g -1)孔容/(cm3·g -1) 孔徑/nm MSN 533.43 ±23.34 1.29 ±0.28 9.93 ±1.62 Rg3-MSN 153.98 ±18.68＊＊ 0.62 ±0.10＊＊ 5.30 ±0.87*

2.2 人參皂苷Rg3-介孔二氧化硅納米粒( Rg3-MSN) 固體分散體的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備，按1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3 (m/m)的比例稱分別稱取人參皂苷Rg3 和MSN，加混合溶劑三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3.5 ∶1)適量，使藥物溶解，在攪拌下自然揮干，然后將其置于真空干燥箱中25 ℃干燥12 h 后，得到Rg3-MSN 不同比例的固體分散體。

2.3 Rg3-MSN 固體分散體的表征

2.3.1 氮?dú)馕脚c脫附(BET)分析［10-11］用比表面積及孔徑分析儀測定人參皂苷Rg3 和Rg3-MSN (1 ∶3)的氮?dú)馕胶兔撐角€，測定之前，樣品在40 ℃的烘箱中干燥12 h。測定結(jié)果如圖2 所示，與MSN 相比，Rg3-MSN 的N2吸附分支向低壓移動(dòng)。用BET 法測算樣品的比表面積，tplot 法計(jì)算微孔體積，BJH 法計(jì)算孔徑。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如表1 所示，載藥之后，介孔二氧化硅納米粒的比表面積，孔徑，孔容積都明顯降低，說明人參皂苷Rg3 被吸附進(jìn)入介孔二氧化硅納米粒的介孔孔道之中。

圖2 MSN 和Rg3-MSN 固體分散體的N2 吸附和脫吸附曲線Fig.2 N2 absorption-desorption isotherms of MSN and Rg3-MSN solid dispersion

2.3.2 差示掃描量熱(DSC)分析［4］采用差示掃描量熱儀，分別測定人參皂苷Rg3 原料藥、MSN、人參皂苷Rg3 和MSN 物理混合物以及Rg3-MSN (1 ∶3)固體分散體的DSC 曲線，加藥量5 ～10 mg，氮?dú)怏w積流量40 mL/min，掃描速度10℃/min，掃描范圍20 ～400 ℃。見圖3。

圖3 MSN、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg3 和MSN 的物理混合物及Rg3-MSN 固體分散體DSC 曲線Fig.3 DSC thermograms for MSN，geinsenoside Rg3，geinsenoside Rg3 and MSN physical mixture and Rg3-MSN solid dispersion

如圖3 所示，319 ℃附近出現(xiàn)的吸熱峰為人參皂苷Rg3 的熔融峰，此峰在人參皂苷Rg3 和MSN的物理混合物中仍然存在，但是人參皂苷Rg3 以1 ∶3 的比例載入MSN 后，其吸熱峰消失，說明人參皂苷Rg3 是以非結(jié)晶的狀態(tài)存在于MSN 中，這是因?yàn)镸SN 的納米孔道很小(氮?dú)馕脚c脫附分析表明MSN 的孔道直徑約為10 nm)，限制了人參皂苷Rg3 結(jié)晶的形成。

2.3.3 X 射線衍射(XRD)［12-13］通過X 射線衍射儀分別測定人參皂苷Rg3 原料藥、MSN、人參皂苷Rg3 和MSN 物理混合物以及Rg3-MSN (1 ∶3)固體分散體的X 射線衍射曲線，掃描角度(2θ)5 ～60°，掃描速度0.5°/min，步長0.02°。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，人參皂苷Rg3 在5.32°、14.72°、17.96°處有特征衍射峰，在人參皂苷Rg3 和MSN的物理混合物中，其特征衍射峰依然存在，但在Rg3-MSN (1 ∶3)的衍射曲線中人參皂苷Rg3 的特征衍射峰消失，說明藥物被全部吸附進(jìn)入MSN 的介孔孔道中，并以非結(jié)晶的狀態(tài)存在，沒有附著在載體表面的結(jié)晶藥物。

圖4 MSN、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg3 和MSN 的物理混合物及Rg3-MSN 固體分散體的X 射線衍射圖Fig.4 XRD patterns for MSN，ginsenoside Rg3，ginsenoside Rg3 and MSN physical mixture and Rg3-MSN solid dispersion

2.3.4 紅外光譜(FT-IR)測定 通過紅外光譜儀測定載體與藥物之間的相互作用，以KBr 為背景，掃描波數(shù)范圍從4 000 ～400 cm-1，結(jié)果如圖5所示，與MSN 和人參皂苷Rg3 的紅外光譜圖相比，Rg3-MSN (1 ∶3)固體分散體的紅外光譜圖無新峰出現(xiàn)，說明介孔二氧化硅納米粒和人參皂苷Rg3未發(fā)生相互反應(yīng)，二者之間的吸附屬于物理吸附。

圖5 MSN、人參皂苷Rg3 及Rg3-MSN 固體分散體的傅利葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of MSN，ginsenoside Rg3 and Rg3-MSN solid dispersion

2.4 人參皂苷Rg3 測定

2.4.1 色譜條件 Welth C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(45 ∶55);體積流量1 mL/min;檢測波長203 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。人參皂苷Rg3 在15.2 min 出峰，如圖6 所示。

圖6 人參皂苷Rg3 高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chrmatograms of ginsenoside Rg3

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的人參皂苷Rg3 對(duì)照品5 mg 于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到500 μg/mL 的貯備液，分別精密量取貯備液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL 于10 mL 量瓶，0.5%的SDS 溶液稀釋定容至刻度。搖勻，取20 μL 進(jìn)液相檢測。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(X)作回歸直線，得回歸方程A=8 060X-2 791.7，r =0.999 7，結(jié)果表明在1 ～50 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.3 回收率的測定 稱取適量的MSN 于0.5%的SDS 溶液中，按照Rg3-MSN (1 ∶3)的比例，精密加入不同量的人參皂苷Rg3 貯備液，配制成低、中、高(5、25、50 μg/mL)3 個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，HPLC 法測定人參皂苷Rg3，計(jì)算人參皂苷Rg3 的回收率為(99.54 ±0.75)%。

2.4.4 精密度的測定 配制人參皂苷Rg3 低、中、高(5、25、50 μg/mL)3 個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，分別一天內(nèi)測定5 次，測得RSD 分別為0.3%、0.4%、0.6%。

2.5 溶解度測定 取人參皂苷Rg3 和Rg3-MSN(1 ∶3)固體分散體分別于裝有5 mL 蒸餾水的試管內(nèi)，使之呈過飽和狀態(tài)，25 ℃恒溫?fù)u床振搖24 h，取液，過0.22 μm 微孔濾膜，HPLC 測定，平行測定3 次，計(jì)算人參皂苷Rg3 在水中的平衡溶解度。結(jié)果人參皂苷Rg3 原料藥的溶解度為(0.84 ±0.16)μg/mL，Rg3-MSN 固體分散體溶解度為(6.35 ±0.45)μg/mL。表明經(jīng)固體分散后人參皂苷Rg3 的溶解度有顯著提高。

2.6 體外溶出度的測定

2.6.1 溶出介質(zhì)的選擇 人參皂苷Rg3 在水中的溶解度極低，一般的溶出介質(zhì)難以達(dá)到漏槽條件，因此需要加入一定量的表面活性劑。在含0.5%的SDS 水溶液中，人參皂苷Rg3 的溶解度約為(278.03 ±12.25)μg/mL，可以滿足漏槽條件，因此選擇0.5%的SDS 水溶液作為溶出介質(zhì)。

2.6.2 體外溶出度的測定 按《中國藥典》2010年版二部釋放度測定第三法，分別稱取人參皂苷Rg3 原料藥及Rg3-MSN 不同比例的固體分散體(相當(dāng)于人參皂苷Rg3 10mg)，置小杯中，釋放介質(zhì)為含0.5%的SDS 水溶液，介質(zhì)體積為250 mL，轉(zhuǎn)速(100 ± 1)r/min，溫度(37 ±0. 5)℃。自樣品粉末接觸溶出介質(zhì)開始計(jì)時(shí)，分別于5、10、15、20、30、45、60 min 取樣3 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，補(bǔ)充同體積新鮮介質(zhì)［6］，HPLC 測定人參皂苷Rg3 質(zhì)量濃度，計(jì)算累積溶出度(見圖7)。結(jié)果表明不同比例固體分散體的溶出速率均比人參皂苷Rg3 原料藥明顯提高，人參皂苷Rg3原料藥1 h 時(shí)累積溶出度不到20%，Rg3-MSN(1 ∶3)固體分散體1 h 的累積溶出可達(dá)82.08%，隨著人參皂苷Rg3 和MSN 比例的減小，溶出變慢，原因是當(dāng)人參皂苷Rg3 和MSN 的比例較小時(shí)，人參皂苷Rg3 不能完全進(jìn)入MSN 的介孔孔道中，一部分人參皂苷Rg3 隨著溶劑的揮發(fā)，附著在MSN的表面，這一部分藥物的依然以結(jié)晶的狀態(tài)存在，因此導(dǎo)致溶出速率的降低。

圖7 人參皂苷Rg3 和不同比例的Rg3-MSN 固體分散體的溶出曲線(±s，n=3)Fig.7 Dissolution profile of ginsenoside Rg3 and Rg3-MSN solid dispersion in different ratios (±s，n=3)

3 討論

3.1 人參皂苷Rg3 在水及多種有機(jī)溶劑中的溶解度均比較差，只在混合溶劑［三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3.5 ∶1)］ 中有較好的溶解度，能達(dá)到20 mg/mL，因此選擇混合溶劑來溶解人參皂苷Rg3，制備Rg3-MSN 固體分散體。

3.2 本實(shí)驗(yàn)所制備的介孔二氧化硅納米粒，能夠在一定程度上改善人參皂苷Rg3 的溶解度和體外溶出速率。介孔二氧化硅納米粒的介孔孔道的空間限制效應(yīng)能夠有效的抑制藥物的結(jié)晶度，降低藥物粒子的大小，從而改善難溶性藥物的水溶性。因此，介孔二氧化硅納米粒在改善難溶性藥物水溶性方面是一種有潛力的載體材料，為納米技術(shù)改善難溶性藥物水溶性研究提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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