宋雙紅， 色林格， 陳 蓓， 崔浪軍， 商 澎*

(1. 西北工業(yè)大學生命學院，陜西 西安710072;2. 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062)

細辛為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag.、漢城細辛Asarum sieboldii Miq. var. seoulense Nakai 或華細辛Asarum sieboldii Miq. 的干燥根及根莖［1］。前兩種習稱“遼細辛”。夏季果熟期或初秋采挖，除去地上部分和泥沙，陰干。細辛性溫味辛，具有祛風散寒、通竅止痛、止咳平喘、溫肺化陰等功效［2］。陜西省是細辛主產(chǎn)區(qū)，其原植物有4 種:華細辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細辛Asarum debile Franch.、毛 細 辛 Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和雙葉細辛Asarum caulescens Maxim。由于目前中醫(yī)習慣使用的遼細辛及華細辛藥源短缺，以致民間有把毛細辛和銅錢細辛作為代用品使用的情況發(fā)生。2005 年版及以前《中國藥典》僅以揮發(fā)油作為細辛藥材質(zhì)量控制指標。《中國藥典》2010 年版中增加了馬兜鈴酸Ⅰ限量測定及細辛脂素的測定。因此本實驗采用高效液相色譜法，對華細辛、毛細辛、銅錢細辛及遼細辛不同部位馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素進行了測定和比較，為細辛藥材的合理用藥和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀(shimadzu LC-2010A)，超聲波清洗器(KQ-600DB)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent1100-Esquire 6000)，MILLI-Q超純水儀，電子天平等。

1.2 實驗試劑 對照品馬兜鈴酸Ⅰ (批號110746-200507)，細辛脂素(批號111889-201001)購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水。

1.3 實驗材料 藥材均采自陜西省寧強縣黃壩驛鎮(zhèn)，由陜西師范大學生命科學學院植物分類研究室田先華教授鑒定，分別為馬兜鈴科植物華細辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細辛Asarum debile Franch.、毛細辛Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和遼細辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥全草。樣品保存于陜西師范大學植物標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 MERCK C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 uL;檢測波長260 nm;以乙腈(A)-0.05% 磷酸水 (B)為流動相，梯度洗脫(0 ～20 min，30%→45%A;20 ～30 min，45%A;30 ～35 min，45% →55% A;35 ～45 min，55% →75%A)，對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及細辛樣品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and sample (B)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定馬兜鈴酸Ⅰ對照品2.34 mg，細辛脂素對照品1.95 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，超聲處理5 min使樣品溶解，待冷卻后得對照品貯備液。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱定60 ℃干燥至恒重的細辛樣品粉末0.63 g (過100 目篩)，置于25 mL錐形瓶中，精確加入70%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，密封，超聲(500 W，40 kHz)處理45 min，取出并冷卻至室溫，稱定并補足損失的質(zhì)量。進樣前搖勻，用0.22 μm 濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 取“2.2”項制備的馬兜鈴酸Ⅰ貯備液，精確稀釋至0.01、0.1、1、10、60、110、160、250 μg/mL，分別進樣10 μL，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y = 1 × 106X - 322.25 (r =0.999 7)，結(jié)果表明馬兜鈴酸Ⅰ在0.01 ～250 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關系。

同樣取細辛脂素貯備液，稀釋至0.6、6、60、90、120、150、200 μg/mL，分別進樣10 μL，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y =1 ×106X -9 342.4 (r =0.999 7)，結(jié)果表明細辛脂素在0.6 ～200 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別取馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素對照品溶液，照“2.1”項色譜條件重復進樣5次，每次10 μL，測得馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素峰面積積分值的RSD 分別為2.5%和0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一份細辛樣品按“2.3”項方法制備5 份樣品，連續(xù)進樣，每次10 μL，測馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素的峰面積積分值的RSD 分別為0.5%和0.6%，表明重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、2、4、10 h 進樣，測定馬兜鈴酸Ⅰ峰面積RSD 為2.6%，細辛脂素峰面積RSD 為0.8%，表明樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素在10 h 內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足本方法測定時間上的要求。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量華細辛根作為實驗樣品，分別準確加入對照品(馬兜鈴酸Ⅰ160 μg/mL，細辛脂素120 μg/mL)0.25，0.5 及1.0 mL，按“2.3”項方法制作供試品，依“2.1”項色譜條件進行測定，分別計算馬兜鈴酸Ⅰ (表1)和細辛脂素 (表2)的加樣回收率［15］。

表1 馬兜鈴酸Ⅰ加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for aristolochic acid Ⅰ

表2 細辛脂素加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for asarinin

2.9 樣品測定 分別取4 種細辛不同部位樣品，按“2.3”項樣品制備方法操作，得各供試品溶液，按“2.1”項色譜方法測定，以外標法計算馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Content of aristolochic acid Ⅰand asarinin in different samples (n=3)

3 質(zhì)譜鑒定

樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛酯素的量都比較低，本實驗在采用對照品驗證的基礎上，又通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，對兩個標準化合物的相對分子質(zhì)量進行了驗證，以確保結(jié)果的準確性。

3.1 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，霧化氣壓為35 psi(1 psi =6.895 kPa)，干燥氣流量為11 mL/min，干燥溫度為350 ℃，質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍為50 ～500。采用全掃描一級質(zhì)譜和選擇離子掃描二級質(zhì)譜兩種方式同時測定。色譜條件同“2.1”項。

3.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果 馬兜鈴酸Ⅰ(相對分子質(zhì)量341.27，結(jié)構(gòu)式見圖2，質(zhì)譜圖見圖3) ［M-H］-離子m/z 340，碎片離子m/z 分別為340、324、293;細辛脂素(相對分子質(zhì)量354.35，結(jié)構(gòu)式見圖4，質(zhì)譜圖見圖5)［M-H］-離子m/z 353，碎片離子m/z 分別為353、339、310。

圖2 馬兜鈴酸Ⅰ結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of aristolochic acid Ⅰ

4 討論

圖3 馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)譜圖Fig.3 MS chromatogram of aristolochic acid Ⅰ

圖4 細辛脂素結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure of asarinin

圖5 細辛脂素質(zhì)譜圖Fig.5 MS chromatogram of asarinin

4.1 馬兜鈴酸又名增噬力酸或木通甲素，在馬兜鈴屬植物中普遍存在并且在個別的幾種中含有量較大。近年來，國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)并報道了不少因服用過量含馬兜鈴酸的中草藥而導致腎衰竭的病例，引起國內(nèi)外的廣泛關注［3］?！吨袊幍洹?005 年版起，已不再收錄廣防己、關木通、青木香等含有馬兜鈴酸的中藥方，并使用其他品種替代。此外，對其他含馬兜鈴酸生藥的藥用部位也進行了更改。如《中國藥典》2000 年版以前細辛的藥用部位均為“全草”，但后來考慮到細辛地上部分馬兜鈴酸含有量較高，且古代中醫(yī)一直僅使用根部， 《日本藥局方》也僅用“根和根莖”，所以《中國藥典》2005年起將藥用部位修訂為根和根莖。 《中國藥典》2010 年版進一步對細辛中馬兜鈴酸Ⅰ進行限量測定［1］。多年來對于細辛中是否含有馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅰ含有量多少及其腎毒性的文獻報道不一，有文獻報道細辛藥材中不含有馬兜鈴酸Ⅰ［4］，也有文獻報道馬兜鈴酸在華細辛、北細辛、單葉細辛中含有量甚微，只有關木通、廣防己、青木香所含馬兜鈴酸的0.15% ～4.8%［5］。因此需要對不同種細辛中馬兜鈴酸進行定量測定，為安全用藥提供參考。

4.2 細辛脂素也廣泛存在于馬兜鈴科的植物中，是細辛中的非揮發(fā)性成分，具有抗病毒和抗結(jié)核桿菌的作用［6］。有文獻報道細辛脂素對免疫有抑制性作用，能夠產(chǎn)生保護受體器官的作用［7］。近年來對細辛中細辛脂素的定量測定鮮有報道?！吨袊幍洹?010 年版將細辛脂素作為細辛藥材的質(zhì)量控制指標之一。因此有必要建立并測定細辛中細辛脂素的量，為細辛藥材質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

4.3 本實驗提取溶劑及提取方法的選擇以華細辛為研究對象，分別比較了甲醇、70%甲醇和乙醇為提取溶劑，超聲和熱回流的提取效果。結(jié)果4 種溶劑的提取率無顯著差異，超聲提取的效果優(yōu)于回流提取，且快速省時，故采用70%甲醇為溶劑，超聲提取45 min。

4.4 色譜條件的選擇和優(yōu)化參照文獻［8］，比較了流動相甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-磷酸水分離效果較佳，故采用乙腈-磷酸水系統(tǒng)為流動相。細辛脂素在287 nm 波長下吸光值較高，但在260 nm 波長下馬兜鈴酸和細辛脂素均具有較高靈敏度［9］，因此檢測波長選用260 nm。該法可以同時檢測兩種待測成分，且達到基線分離，符合定量測定的要求［10］。

4.5 《中國藥典》2010 年版對馬兜鈴酸Ⅰ進行了限量，依高效液相色譜法測定，按干燥品計算，馬兜鈴酸Ⅰ的含有量不得過0.001%。而細辛脂素作為細辛的指標成分之一，按干燥品計算，含細辛脂素不得少于0.050%［1］。本實驗檢測結(jié)果，根和莖中馬兜鈴酸Ⅰ的量都低于《中國藥典》2010 年版規(guī)定標準，葉中含有量較高，故以根及根莖入藥是比較安全的。細辛脂素在華細辛和遼細辛根、莖、葉中均檢測到，但在毛細辛中未檢測出，銅錢細辛除莖外，也未測出細辛脂素?？梢姴煌N細辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素的量差別較大，且同一種細辛地上部分和地下部分馬兜鈴酸Ⅰ的量亦有較大差別，提示用藥上應合理取材。有文獻分析比較同一產(chǎn)地華細辛、毛細辛和銅錢細辛的揮發(fā)性成分。結(jié)果3 種細辛揮發(fā)性成分在數(shù)量和含有量上各有差異，此外3 種細辛均含有獨特的揮發(fā)性成分［11-13］。全面評價藥材質(zhì)量需綜合多種揮發(fā)性成分及非揮發(fā)性成分［14］。從臨床用藥安全考慮，建議廠家應對細辛藥材進行用藥部位篩選和馬兜鈴酸的限量檢查，既要保證藥效，又要保證毒性成分的用量在允許范圍內(nèi)。

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