趙 鵬， 張婷婷， 張麗華， 宋 逍

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽712046)

缺鐵性貧血(iron deficiency anaemia，IDA)是一種常見的營養(yǎng)性疾病。目前，臨床上用于治療IDA 的藥物主要是硫酸亞鐵制劑，其存在生物利用度低和較大的胃腸刺激性等缺點［1］。因此急需開發(fā)出一種含鐵量高、溶解性好及副作用小的新型補(bǔ)鐵劑來滿足臨床治療IDA 的需要。

近年來，以三價鐵為核心，生物活性多糖為配體的多糖鐵絡(luò)合物正成為研制新型補(bǔ)鐵劑研究熱點，研究者們開發(fā)出了一系列不同多糖配體的多糖鐵類絡(luò)合物［2-6］，而以力蜚能為代表的多糖鐵復(fù)合物制劑則早已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段［7］。相較于傳統(tǒng)補(bǔ)鐵劑，多糖鐵絡(luò)合物具有副作用小、配合性穩(wěn)定、溶解度好，含鐵量高等優(yōu)點，對治療缺鐵性貧血具有較好的療效，此外，作為配體的多糖一般都具有提高免疫、抗氧化性等多方面的生物活性，在補(bǔ)鐵的同時，還可進(jìn)一步提高機(jī)體免疫力，因此其是一種比較理想的補(bǔ)鐵劑［8］。

倒卵葉五加Acanthopanax obovatus Hoo 屬五加科五加屬植物，分布于陜西、寧夏、甘肅等地［9］。倒卵葉五加多糖是其主要的活性成分之一，具有明顯的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化性等生物活性［10-11］。鑒于此，本研究以陜西產(chǎn)倒卵葉五加為原料，從中提取倒卵葉五加多糖，與鐵(Ⅲ)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，研究制備倒卵葉五加多糖鐵(Ⅲ)絡(luò)合物(縮寫為AHC，下同)的合成工藝路線，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了其合成工藝條件，并對AHC 的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 倒卵葉五加購自陜西省西安萬壽路中藥材批發(fā)市場(經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院宋逍副教授鑒定為倒卵葉五加Acanthopanax obovatus Hoo 的干燥根、莖);檸檬酸三鈉、三氯化鐵、無水乙醇、三氯甲烷、石油醚(60 ～90 ℃)、氫氧化鈉、鄰菲啰啉、Vc、K4［Fe(CN)6］ 等試劑均為分析純。

UV-2501PC 紫外可見分光光度儀(日本島津公司);FA2004 電子天平(上海精科天平廠);4K15 臺式離心機(jī)(Sigma 公司);ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 倒卵葉五加多糖的制備 將倒卵葉五加的根莖在80 ℃下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用石油醚在回流下脫脂2 次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1 ∶15 (g/mL)80 ℃下提取2 次，提取液合并，再按1 g 生藥材濃縮為1 mL 進(jìn)行濃縮，濃縮液經(jīng)脫蛋白、脫色處理后，用4 倍體積量的無水乙醇醇沉，即得倒卵葉五加粗多糖，將其用截留分子質(zhì)量為3 500 透析袋流動水透析48 h，透析液濃縮，再醇沉，即得制備倒卵葉五加多糖鐵的原料，此時多糖的含有量為84.9%。

1.2.2 AHC 的合成 稱取一定量的倒卵葉五加多糖和檸檬酸三鈉，溶于雙蒸水中，水浴加熱至一定溫度，此時，逐滴交替加入2 mol/L FeCl3溶液和20%NaOH 溶液，控制溶液的pH 在合適的范圍內(nèi)。當(dāng)上述反應(yīng)液中生成不溶性的沉淀時，即停止加入FeCl3和NaOH，繼續(xù)反應(yīng)1 h 后冷卻。將反應(yīng)液過濾，除去沉淀，濾液用4 倍量的無水乙醇沉靜至過夜后過濾，將濾餅用無水乙醇和乙醚洗滌后，真空干燥，即得AHC，具體工藝路線如圖1 所示。

1.2.3 AHC 制備工藝條件優(yōu)化 本研究按照Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，以倒卵葉五加多糖鐵中鐵的含有量作為響應(yīng)值，采用反應(yīng)溫度、配料比(多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比)和pH 等三個對倒卵葉五加多糖鐵中含鐵量影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，實驗因素和水平設(shè)計如表1 所示。

圖1 倒卵葉五加多糖鐵(Ⅲ)絡(luò)合物制備工藝流程

表1 實驗因素水平

1.2.4 AHC 中含鐵量測定 參照文獻(xiàn)［2］，采用鄰菲羅啉分光光度法測定AHC 中鐵的含有量。

1.2.5 AHC 的還原性試驗 參照文獻(xiàn)［2］，采用鄰菲羅啉比色法對AHC 進(jìn)行還原性試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHC 合成工藝

2.1.1 響應(yīng)面優(yōu)化分析 本研究依據(jù)單因素實驗結(jié)論，以AHC 的含鐵量為指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化AHC 的合成工藝，響應(yīng)面分析結(jié)果見表2 ～3。

表2 響應(yīng)面分析實驗方案及實驗結(jié)果

采用Design-Expert 7.01 軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的結(jié)果進(jìn)行研究，研究結(jié)果見表2，按照各因素對試驗結(jié)果的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到下式:

表3 方差分析

根據(jù)表3 中所得到的分析結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，回歸方程的F 值為109.32，其顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，這說明，利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗?zāi)Ｐ惋@著性極高，利用擬合模型回歸得到的二次方程，分析其因變量和自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后可以看到，r =286.04/288.08 =0.992 9，這一點說明用該數(shù)學(xué)模型來評估各相關(guān)因素對AHC 中含鐵量的影響真實可靠。從表3 的方差分析結(jié)果可以看出，響應(yīng)面試驗組合的各單因素中，對AHC 中含鐵量影響最大的是配料比，其次是反應(yīng)溫度，pH 的影響最小，為不顯著影響因素。

對回歸方程 (1)求一階偏導(dǎo)［12］，可得出:X1=-0.49，X2=0.87，X3=0.18;由此可得到按照回歸模型預(yù)測合成AHC 的最優(yōu)工藝條件是:反應(yīng)溫度為75.1 ℃，配料比為3.87，pH 值為8.09，在此工藝條件下，預(yù)測得到的AHC 中含鐵量為19.45%。

2.1.2 驗證試驗 根據(jù)預(yù)測的實驗結(jié)果，并從實際工藝操作方便考慮，微調(diào)AHC 合成的最佳工藝條件為:溫度為75 ℃，配料比為3.9，pH 為8.0，在此工藝條件下重復(fù)操作3 次，得到的AHC 中含鐵量的平均值為19.43%，這說明通過回歸方程預(yù)測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。

2.2 AHC 的理化性質(zhì)

2.2.1 AHC 的一般理化性質(zhì) AHC 的外觀呈紅棕色，是無定形粉末，熔點較高(＞300 ℃)，難溶于常見的有機(jī)溶劑，易溶于水，得到的溶液為中性。將K4［Fe(CN)6］ 溶液滴入AHC 的水溶液中，結(jié)果未發(fā)生Fe (Ⅲ)離子的顯色反應(yīng)，這說明AHC 是以絡(luò)合物的形式存在于水溶液，沒有游離的Fe3+存在。當(dāng)調(diào)節(jié)AHC 的水溶液的pH 4 ～12 范圍內(nèi)變動時，發(fā)現(xiàn)無沉降、水解現(xiàn)象出現(xiàn)，這說明AHC 具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.2 AHC 的還原性試驗 稱取0.005 g 的AHC，溶于一定量的雙蒸水中，加入10%的Vc 水溶液5 mL 和0.12%的鄰菲羅啉溶液5 mL，NaAc 溶液5 mL，用50 mL 的量瓶定容后，在恒溫37 ℃下不斷攪拌，在不同的時間點取樣，以不加入AHC 的溶液做空白，510 nm 波長處測定吸光度(A)。結(jié)果見圖2。

圖2 AHC 與Vc 反應(yīng)體系的A-t 曲 線

由圖2 可知，AHC 在3 h 內(nèi)基本能被Vc 逐漸還原成Fe(Ⅱ)，可見AHC 具有良好的溶出被還原性能，這說明AHC 作為口服補(bǔ)鐵劑時，可被還原性物質(zhì)將其中的Fe(Ⅲ)還原為Fe (Ⅱ)，從而被機(jī)體所吸收，具有較好的生物利用度。

3 結(jié)論

3.1 本研究利用檸檬酸三鈉-三氯化鐵法得到了AHC，并通過響應(yīng)面法確定了合成的最優(yōu)工藝條件為:溫度為75 ℃，配料比為3.9，pH 為8.0，在此工藝條件下重復(fù)操作3 次，得到的AHC 中含鐵量的平均值為19.43%。

3.2 通過對AHC 的理化性質(zhì)和還原性試驗可知AHC 的水溶液中不含游離的Fe3+，這說明其具有較小的胃腸道刺激的副作用，而且其在3 h 內(nèi)基本能被Vc 還原為Fe (II)，具有較好的生物利用度。

［1］ 黃家錕，蔣開年，王鳳娟，等. 紅景天多糖鐵的合成及抗缺鐵性貧血作用的研究［J］. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29(3):58-62.

［2］ 李 琳，李穩(wěn)宏，雒 羽，等. 二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的制備及理化性質(zhì)研究［J］. 食品科學(xué)，2012，16(33):54-58.

［3］ 許麗麗，展曉日，曾昭武. 玉竹多糖鐵的制備及其理化性質(zhì)研究［J］. 中國藥學(xué)雜志，2012，3(47):331-334.

［4］ 趙 兵，徐清海. 枸杞多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及理化性質(zhì)的初步研究［J］. 中成藥，2008，30(8):1245-1246.

［5］ 李明靜，楊 靜，王 寧，等. 懷山藥多糖鐵(Ⅲ)的組成及性能表征［J］. 中國中藥雜志，2008，33 (16):2002-2005.

［6］ 李玉賢，裴曉紅. 大棗多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及一般性質(zhì)研究中成藥［J］. 中成藥，2006，28(5):707-709.

［7］ 羅春華，張雅鷗，馬 廉. 力蜚能溶液劑治療缺鐵性貧血臨床觀察［J］. 實用兒科臨床雜志，1995，10 (5):301-302.

［8］ 張惠中. 口服補(bǔ)鐵劑多糖鐵復(fù)合物［J］. 中國藥師，2006，9(8):756-757.

［9］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:243.

［10］ 李宗友. 倒卵葉五加根中抗腫瘤多糖引起巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)改變［J］. 國外醫(yī)學(xué)，1994，16(3):43.

［11］ 齊香君，陳 立，朱愛華，等. 倒卵葉五加多糖提取分離工藝研究［J］. 食品工業(yè)科技，2010，31(10):298-300.

［12］ 趙 鵬，李穩(wěn)宏，朱驟海，等. 款冬花多糖提取工藝的研究［J］. 中成藥，2010，32(1):58-61.