王 姣， 周日寶 ， 單自強， 廖麗萍， 徐玉琴

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙410208;2. 郴州大誠中藥飲片有限責(zé)任公司，湖南 郴州423000)

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver 的干燥樹皮，是我國特產(chǎn)的名貴滋補藥材［1-2］。具有補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等諸多功效［3-6］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，謂其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老”。

湖南省桂東縣位于羅霄山脈中段，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，境內(nèi)山地資源豐富，土質(zhì)、氣候條件適合杜仲藥材品種生長，為杜仲傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，杜仲栽培應(yīng)用歷史悠久，大規(guī)模商品化、產(chǎn)業(yè)化種植也已經(jīng)有三十多年歷史了。

杜仲藥材的主要化學(xué)成分有松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、杜仲膠等［7-9］。松脂醇二葡萄糖苷是《中國藥典》2010 年版評價杜仲藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)［10-12］。本實驗采用高效液相色譜法對湖南省桂東縣杜仲GAP 基地杜仲不同品種和不同生長年限樣品松脂醇二葡萄糖苷的量及其動態(tài)變化規(guī)律進行了比較研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260LC 高效液相色譜儀，含二元泵、柱溫箱、手動進樣器、紫外檢測器，ZORBAX Eclipse XDB-C18色 譜 柱 (4. 6 mm ×250 mm，5 μm)(安捷倫科技有限公司);十萬分之一電子天平 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 松脂醇二葡萄糖苷對照品(購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號:MUST-12021001);液相用甲醇為色譜純，液相用水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材 杜仲藥材樣品共10 批，均采自于湖南省桂東縣杜仲GAP 基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品0.004 97 g，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.49 mg/mL 的對照品貯備液。

2.1.2 樣品溶液的制備［13-14］取樣品3 g，剪成碎片，揉成絮狀，取2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷適量，加熱回流6 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，再置索氏提取器中，加人甲醇適量，加熱回流6 h，提取液回收甲醇至適量，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 有機微孔濾膜濾過，取得的濾液即為藥材樣品溶液。

2.2 色譜條件［13，15］ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-水(25 ∶75);體積流量為1.0 mL/min;紫外檢測波長為277 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為5 μL。在該色譜條件下，松脂醇二葡萄糖苷分離度良好，結(jié)果分別見圖1 (按《中國藥典》要求，理論塔板數(shù)按松脂醇二葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于1 000)。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取松脂醇二葡萄糖苷對照品溶液(0.49 mg/mL)1、2、4、6、8、10 μL 溶液，注入液相色譜儀中，測定其色譜峰面積，以松脂醇二葡萄糖苷進樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y 進行線性回歸，得回歸方程為Y=454.7X +24.92，r2=0.999 9。結(jié)果表明松脂醇二葡萄糖苷在0.49 ～4.90 μg 范圍內(nèi)，進樣量與其色譜峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一質(zhì)量濃度樣品溶液5 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算得松脂醇二葡萄糖苷的RSD 為1.58% (n =6)，表明實驗儀器的精密度良好。

圖1 杜仲對照品和樣品HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of Eucommia ulmoides reference substance and sample

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一質(zhì)量濃度樣品溶液，分別于制備后0、3、6、12、24、48 h 進樣5 μL，測定并記錄峰面積，計算得松脂醇二葡萄糖苷的RSD 為1.96% (n =6)，表明樣品溶液中松脂醇二葡萄糖苷在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一質(zhì)量濃度樣品平行制備6 份溶液，分別精密吸取5 μL 并進樣，記錄峰面積，計算得松脂醇二葡萄糖苷的RSD 為1.69%(n=6)，表明本方法的重復(fù)性好。

2.4.4 回收率試驗 取同一已知含有量的絮狀樣品(含松脂醇二葡萄糖苷為0.11%)約1 g，6份，精密稱定，另取松脂醇二葡萄糖苷對照品粉末約1 mg，同時加入索氏提取器中，按照“2.1.2”項下樣品溶液制備方法制備，并分別進行測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果表明，本方法的回收率符合要求，見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.5 樣品測定 分別精密稱取每個樣品各2 g，按照“2.1.2”項制備樣品溶液，按前述色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表2 湖南省桂東縣杜仲GAP 基地杜仲樣品測定結(jié)果Tab.2 Determination results of Eucommia ulmoides from Guidong County，Hunan Province GAP base

2.6 數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析 將不同生長年限、不同品種類型與松脂醇二葡萄糖苷量三個變量用Spss 17.0 軟件進行方差分析，分析結(jié)果見表3，Corrected Model (模型檢驗)的F =33.018，P =0.002，所選模型具有統(tǒng)計意義;分層因素生長年限的F =39.304，P =0.002，說明不同生長年限對松脂醇二葡萄糖苷量的影響有統(tǒng)計學(xué)意義;分層因素品種類型的F =7.875，P =0.049，說明不同品種類型對松脂醇二葡萄糖苷量的影響有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 生長年限、品種類型與松脂醇二葡萄糖苷量方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results of growth years，variety types and PDG contents

3 討論

3.1 不同品種杜仲樣品中松脂醇二葡萄糖苷的含有量比較 根據(jù)杜仲皮的形態(tài)特征，目前，我國劃分出粗皮杜仲、光皮杜仲類型樹種。粗皮杜仲，習(xí)稱青杠皮。幼年植株樹皮呈青灰色，不開裂，皮孔顯著。成年植株樹皮變成褐色，皮孔消失，開始發(fā)生裂紋，不脫落，落皮層 (外樹皮)及韌皮部(內(nèi)樹皮)分明，外皮粗糙，類似櫟類樹皮。光皮杜仲，習(xí)稱白楊皮。幼年樹的特征基本上與粗皮杜仲相似。成年植株樹皮變?yōu)榘咨?，皮孔部分逐漸消失，除樹干基部以上1 米以內(nèi)漸次發(fā)生淺裂，其余主干、側(cè)枝樹皮均不發(fā)生裂紋，落皮層及韌皮部不分明，樹皮光滑。

從表2 中可以看出，湖南省桂東縣GAP 基地杜仲無論是哪個生長年限，品種光皮杜仲藥材中松脂醇二葡萄糖苷的量高于同期粗皮杜仲的?？晒┧幱煤吞崮z的韌皮部(內(nèi)樹皮)厚度與質(zhì)量，光皮杜仲顯著優(yōu)于粗皮杜仲。因此，光皮杜仲應(yīng)是生產(chǎn)上選優(yōu)和繁殖的品種。

3.2 不同生長年限杜仲樣品松脂醇二葡萄糖苷的含有量動態(tài)變化規(guī)律 從表2 中也可以看出，湖南省桂東縣GAP 基地杜仲無論是光皮杜仲或是粗皮杜仲，隨著生長年限的增加，藥材中松脂醇二葡萄糖苷的量也逐漸增加。除5 年生的植株外，10 年生及以上的杜仲藥材中松脂醇二葡萄糖苷的量高于《中國藥典》2010 年版松脂醇二葡萄糖苷的量不得低于的0.10%要求。因此杜仲藥材的采收要選擇10 年及以上植株的。

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