鄧 鳴， 朱 斌* ， 賓春燕

(1. 廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧530021;2. 廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧530021)

展青霉素是擴(kuò)展青霉、展青霉、圓弧青霉等真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種遺傳毒性化合物，存在致畸性、致癌性和免疫毒性［1］。由于展青霉素對(duì)人類可能造成的危害，世界上許多國(guó)家都規(guī)定了食品中展青霉素的限量值，我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2761 -2011《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定展青霉素的限量為50 μg/kg。展青霉素主要存在酸性果實(shí)中，在蘋果、山楂及其制品中檢出較多［2-3］。中藥及中成藥中亦有許多酸性果實(shí)類藥材入藥，但目前展青霉素檢測(cè)研究報(bào)道多集中于果實(shí)類食品而關(guān)于中藥相應(yīng)檢測(cè)方法報(bào)道較少。山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒的主要原料均為山楂、麥芽及六神曲，這些中藥材有可能受到真菌毒素污染，因此有必要檢查其中展青霉素量，保證用藥安全。

近幾年來(lái)測(cè)定展青霉素的方法主要有高效液相色譜法［4-7］以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8-10］，前處理方法有液液萃取 法［4，7］、固 相 萃 取 法［8，11］、多 功 能 凈 化 柱 凈 化法［5，10］等。液液萃取法的提取溶劑為乙酸乙酯，需消耗較多有機(jī)溶劑，操作步驟較為繁瑣。固相萃取法常用C18或HLB 小柱進(jìn)行提取液的凈化，與液液萃取方法相比，樣品用量和溶劑用量均明顯減少，樣品的純化和富集過程可同時(shí)完成，縮短樣品處理時(shí)間。多功能凈化柱可選擇性吸附樣液中的雜質(zhì)，而待測(cè)組分真菌毒素不被吸附而直接通過，該方法操作步驟簡(jiǎn)單，凈化過程一步完成，已越來(lái)越多地應(yīng)用于展青霉素測(cè)定中。分子印跡固相萃取柱，是運(yùn)用分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)原理，模擬抗原抗體反應(yīng)模式，將樣品中的目標(biāo)分子進(jìn)行特異性提純處理和富集。目前針對(duì)真菌毒素的分子印跡固相萃取柱的使用已經(jīng)有了一定的發(fā)展，并得到了廣泛的關(guān)注［12］。實(shí)驗(yàn)中成功運(yùn)用了展青霉素分子印跡柱對(duì)中成藥提取液進(jìn)行凈化，其凈化過程迅速，選擇性高，可有效去除中藥中眾多干擾物質(zhì)。該方法的建立為更好地評(píng)價(jià)和控制山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒質(zhì)量提供依據(jù)，也為其他中成藥中的展青霉素測(cè)定提供參考方法。

1 儀器與材料

Agilent1200 型液相色譜儀(Agilent 公司);Milli-Q 去離子水發(fā)生器(Milli-Q 公司);OA-SYS 氮吹儀(Ttettich公司)。

展青霉素(patulin)對(duì)照品購(gòu)于Supelco 公司，批號(hào)LB81487，純度96.592%;羥甲基糠醛(HMF)對(duì)照品購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer Gmbh 公司，批號(hào)80606，純度98.7%;甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑為分析?展青霉素分子印跡柱購(gòu)于R. Biopharm 公司，Oasis HLB 固相萃取小柱(500 mg/6 mL)購(gòu)于Waters 公司，Mycosep 228 AflaPat 多功能凈化柱購(gòu)于Romer 公司。

3 批山楂麥曲顆粒(15g/袋)、2 批大山楂顆粒(15 g/袋)樣品購(gòu)自本地藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0 ～15 min，4% A;15 ～20 min，4% ～40% A;20 ～25 min，40% A;25 ～30 min，40% ～4% A)，體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量50 μL;柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。

2.2 樣品制備 將供試品研細(xì)，稱取約1 g 置于25 mL 具塞三角瓶中，加入5 mL 1%醋酸溶液，振搖溶解后超聲提取5 min (超聲頻率40 kHz)。依次用2 mL 乙腈、2 mL 水淋洗活化小柱，取上述提取液于已活化的分子印跡柱上，自然重力滴下，分別用1 mL 1%碳酸氫鈉溶液和2 mL 水淋洗，抽真空使柱子干燥，然后加入3 mL 乙酸乙酯溶液洗脫展青霉素，收集洗脫液于氮?dú)饬飨?0 ℃吹至近干，加入0.1%醋酸溶液溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取展青霉素適量用甲醇配制成1 mg/mL 貯備液，置于4 ℃保存，臨用時(shí)用0.1%乙酸溶液稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。取羥甲基糠醛適量用甲醇配制成1 mg/mL 貯備液，置于4 ℃保存。

2.4 線性關(guān)系及檢測(cè)限 取展青霉素貯備液適量，配制成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以化合物峰面積(Y)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到展青霉素線性范圍4.83 ～96.59 ng/mL，線性方程Y=0.377X+0.030 6，相關(guān)系數(shù)r 為0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.5 回收率試驗(yàn) 稱取同一批陰性大山楂顆粒樣品9 份，每份約1 g，分別按50、20、5 μg/kg 水平添加展青霉素對(duì)照品溶液，每個(gè)水平3 份供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果展青霉素回收率在72.9% ～86.0%之間，RSD 在3.3% ～7.1%之間。

表1 展青霉素加標(biāo)回收率

2.6 檢測(cè)限 測(cè)定低添加水平回收率供試品溶液的信噪比，按信噪比為3 計(jì)算，方法檢測(cè)限為3 μg/kg。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果 應(yīng)用建立的方法將收集到的3 批山楂麥曲顆粒、2 批大山楂顆粒進(jìn)行測(cè)定，均未檢出展青霉素。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 流動(dòng)相的組成及比例對(duì)待測(cè)組分的峰形、分離度均有影響。實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙腈-水、四氫呋喃-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)等這3 種流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，結(jié)果四氫呋喃系統(tǒng)、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)系統(tǒng)的分離效果較差，而乙腈-水體系能很好地將展青霉素與雜質(zhì)峰分離。通過調(diào)整流動(dòng)相比例，當(dāng)乙腈與水的比例為4 ∶96時(shí)，展青霉素出峰時(shí)間合適且分離度好。實(shí)驗(yàn)中還比較了Kromasil 100-5 C18、Hypesil ODS2 C18和Agilent XDB C18色譜柱的分離效果，在乙腈-水體系下以Kromasil 100-5 C18柱的分離效果最好，且峰形尖銳，靈敏度高。因此選擇Kromasil 100-5 C18柱為分析柱，4%乙腈為流動(dòng)相作為色譜分離系統(tǒng)(圖1 ～3)。

圖1 展青霉素對(duì)照溶液

圖2 陰性樣品溶液

圖3 加標(biāo)樣品溶液

羥甲基糠醛是果實(shí)中己酮糖在酸性或高溫環(huán)境下脫水形成的產(chǎn)物，與展青霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，表現(xiàn)出相似的色譜行為，因此，羥甲基糠醛成為展青霉素測(cè)定時(shí)最常見、最易混淆的干擾物。在上述色譜系統(tǒng)下，將羥甲基糠醛和展青霉素的混合對(duì)照液進(jìn)樣，結(jié)果兩者分離良好(圖4)。

圖4 羥甲基糠醛、展青霉素混合溶液

3.2 樣品提取凈化條件的考察 中藥制劑中含有眾多成分，而展青霉素又是痕量存在的，需要采用適當(dāng)?shù)奶崛『蛢艋绞絹?lái)對(duì)樣品進(jìn)行處理，以便盡可能地減少干擾，提高分析靈敏度。由于顆粒劑中含有大量的糖分，若提取溶劑量少則提取溶液黏稠，不易通過凈化小柱，反之溶劑量過大則增加凈化時(shí)間。通過比較，確定加入5 mL 提取液時(shí)，溶液黏度適中，過柱耗費(fèi)時(shí)間合適。超聲提取時(shí)間影響提取效率，實(shí)驗(yàn)中考察了提取時(shí)間分別為2、5、10 min的提取回收率，在5 min 時(shí)，提取回收率已經(jīng)達(dá)到最大，增加超聲時(shí)間，回收率并未顯著增大。因此將提取溶劑體積定為5 mL，超聲提取時(shí)間為5 min。

實(shí)驗(yàn)中比較了常用于展青霉素凈化的幾種小柱的凈化效果:Oasis HLB 柱，mycosep 228 AflaPat 多功能凈化小柱和展青霉素分子印跡柱。結(jié)果表明Oasis HLB 柱，mycosep 228 Aflapat 多功能凈化小柱的凈化效果不能滿足要求，有雜質(zhì)峰干擾展青霉素的測(cè)定，經(jīng)過更換流動(dòng)相組成及比例均難以將雜質(zhì)與展青霉素分開，而采用展青霉素分子印跡柱凈化后的供試液無(wú)雜質(zhì)干擾，基線平穩(wěn)，可準(zhǔn)確地分析展青霉素，因此選擇分子印跡柱作為凈化方式。

實(shí)驗(yàn)中考察了在分子印跡柱上不同的洗脫溶劑 (乙醚、乙腈、甲醇、乙酸乙酯)對(duì)加標(biāo)樣品的洗脫效果，結(jié)果表明乙酸乙酯的平均回收率最高，為77.1%，甲醇和乙醚的平均回收率分別為52.3%、40.5%，乙腈洗脫溶液中有干擾峰，未能計(jì)算回收率。比較之下乙酸乙酯洗脫色譜圖雜質(zhì)干擾峰少，回收率較高，洗脫效果好，因此，選擇乙酸乙酯作為洗脫液。

本實(shí)驗(yàn)建立了山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒中展青霉素的高效液相色譜檢測(cè)方法，采用展青霉素分子印跡固相親和柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化可很好地去除干擾物，提高分析方法的專屬性。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，回收率好，適用于中藥制劑的展青霉素的測(cè)定。

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