安 琳， 張 燕， 崔 宇， 王友升，*

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.江陰中利生物技術(shù)有限公司，江蘇江陰 214400）

二級蒸餾對竹醋液抑菌與抗氧化效果的影響

安 琳1， 張 燕1， 崔 宇2， 王友升1，*

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；
2.江陰中利生物技術(shù)有限公司，江蘇江陰 214400）

比較了一級蒸餾和二級蒸餾竹醋液的抑菌效果以及其自由基清除能力、總酚和總黃酮的含量，并通過高效液相色譜對相關(guān)活性組分含量進行分析.結(jié)果表明：一級蒸餾和二級蒸餾竹醋液對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠酵母、黑曲霉均表現(xiàn)出較好的抑制效果和較強的抗氧化能力，但二級蒸餾會顯著降低竹醋液的抑菌能力及抗氧化能力.此外，高效液相色譜檢測結(jié)果表明，二級蒸餾后竹醋液在254 nm和270 nm波長下吸收峰的數(shù)量和峰面積均顯著降低.

竹醋液；二次蒸餾；抑菌；抗氧化；高效液相色譜

竹醋是竹炭生產(chǎn)的副產(chǎn)物，即竹材經(jīng)炭化、熱解產(chǎn)生的具特殊焦煙氣味的黃色或紅褐色液體［1］.竹醋具有去異味、殺菌、除蟲、抗病毒、促進植物生長、防止血糖降低等作用，因此作為一種綠色、天然、環(huán)保的新資源，竹醋在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、化工食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［2-3］.研究表明，竹醋可以延緩草魚肉塊腐敗變質(zhì)，延長其貨架期［4］.竹醋與殼聚糖復(fù)配用于圣女果保鮮，既可延長保藏時間，又不損害果實的外觀及品質(zhì)［5］.竹醋的超氧陰離子、二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除能力與茶多酚相近［6-7］，但竹醋液具有的特殊焦煙氣味可能會影響食品的風(fēng)味，從而限制其在食品保鮮中的應(yīng)用.因此，需要對竹醋液通過二級蒸餾進行精制，精制后的竹醋液較原液更加透明，煙熏酸味變淡［8］.然而，二級蒸餾后對竹醋液的抑菌能力、抗氧化能力及功效組成成分含量的影響還鮮有報道.因此，本研究考察并比較了竹醋一級蒸餾和二級蒸餾液的抑菌性能、抗氧化性及代謝指紋圖譜，以期為將精制竹醋液開發(fā)成抑菌、殺菌、防腐劑等產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

竹醋液由江陰中炬生物科技有限公司提供，制作純化采用江陰中炬生物科技有限公司2010-1型竹木醋提取提純設(shè)備.竹醋液制備工藝為竹材破碎后制成竹片，然后將其干餾和炭化，進行兩級冷凝，并將兩級冷凝所得的竹醋液在混合罐中混合后靜置.將pH值為2.5～3.0的竹醋液置于40～100℃、真空度0.080MPa以上的條件下進行一級蒸餾，至餾出體積為原液體積的80%～90%時即可，所得到的餾出液，進行冷凝歸集.將一級蒸餾液置于40～100℃、真空度0.085 MPa以上的條件下進行二級蒸餾，至餾出體積為原有體積的80%～90%時即為二級蒸餾液.

1.1.2 試劑

三吡啶三吖嗓（TPTZ）、2，2＇-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并唾唑啉-6-磺酸）（ABTS）、二苯代苦味?；―PPH）等均購于Sigma-Aldrich公司.色譜純的甲醇和乙酸購自Fisher公司，其他試劑均為分析純.

1.1.3 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠酵母（Canidia albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）均為本實驗室保存.

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水補足1 L，121℃滅菌15 min.LB培養(yǎng)基：胰蛋白陳10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂18 g，加水補足1 L，用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.2，121℃滅菌15 min.YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白陳20 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水補足1 L，121℃滅菌15min.

1.2 實驗儀器

DH 500 AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SHH-50L型生化培養(yǎng)箱，重慶四達實驗儀器有限公司；MJX-250Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，廣州省醫(yī)療器械廠；T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；QL-901型振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；CL200+型筆式余氯/pH/ORP計，上海三信儀表廠；ES-300A型電子天平，長沙湘平科技發(fā)展有限公司，1100型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC），安捷倫公司；UV2450型分光光度計，Shimadzu公司.

1.3 測定方法

1.3.1 濾紙片擴散法測定抑菌作用

取竹醋液于超凈工作臺中用無菌水配成體積分?jǐn)?shù)為70%，50%，30%，20%，10%的稀釋液.取50 μL菌懸液（細(xì)菌濃度為1×106個/m L，真菌為1× 105個/m L）鋪板，將濾紙片放至平板中央，加30μL樣品，以水作對照.適溫培養(yǎng)（細(xì)菌37℃培養(yǎng)，霉菌25℃培養(yǎng)，酵母28℃培養(yǎng)），待對照長滿后，測量抑菌圈直徑.

1.3.2 比濁法測定殺菌作用

每支試管加入2.5mL配置好的樣品-培養(yǎng)基混合物，然后再加入0.5mL菌懸液，菌懸液濃度分別為：細(xì)菌1×107個/mL；白色念珠酵母1×107個/mL；黑曲霉600 nm下的透光度T=75%（±2%）.充分震蕩后，搖床培養(yǎng)，細(xì)菌37℃、150 r/min，黑曲霉的培養(yǎng)條件為25℃、150 r/min，酵母的培養(yǎng)條件為28℃、150 r/min.培養(yǎng)24 h.取50μL菌液涂板.E.coli、S.aureus于37℃培養(yǎng)，A.niger于25℃中培養(yǎng)，酵母于28℃培養(yǎng).待對照長滿板后，觀察結(jié)果.

1.3.3 抗氧化指標(biāo)的測定

總抗氧化能力的測定參考文獻［9］并略有改進.測量體系含0.2mL樣品，3mL TPTZ工作液和0.3mL醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L，pH=3.6），37℃下放置45min后于593 nm下測其吸光度，樣品總自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示（U/mL）.

參考文獻［10］進行清除DPPH自由基能力的測定，將對DPPH自由基50%清除率定義為1個活性單位（U），清除DPPH自由基能力以每克鮮重樣品中含有的活性單位來表示（U·（g·fw）-1）.

經(jīng)自由基清除能力的測定依據(jù)劉駿的方法［11］.將對經(jīng)自由基50%清除率定義為1個活性單位（U），清除經(jīng)自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示（U/mL）.

總還原能力的測定參考文獻［12］.0.2 mL樣品，1.0m L磷酸緩沖液（PBS）（0.2 mol/L，pH值為6.6）和1.0m L 1%鐵氰化鉀混合均勻，于50℃水浴鍋中放置20min，取出后立即冷卻，體系降溫后加入1.0mL 10%三氯乙酸（TCA），充分混勻后取出1 mL，再加入2m L蒸餾水和0.3mL 0.1%FeCl3，放置10 min后于700 nm下測其吸光度.

超氧陰離子能力的測定采用氮藍四唑光照法［13］.將對超氧陰離子50%清除率定義為1個活性單位（U），清除超氧陰離子自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示（U/mL）.

1.3.4 總酚和總黃酮的測定

總酚的測定參照文獻［14］，略有改進.以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總酚含量換算為每毫升樣品中沒食子酸的含量（μg/m L）.

總黃酮的測定參照文獻［15］進行.以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中總黃酮含量換算為每毫升樣品中蘆丁的含量（μg/m L）.

1.3.5 竹醋的HPLC指紋圖譜分析

竹醋樣品采用HPLC，選用254，270 nm波長進行分析.色譜條件：ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為1%乙酸水溶液（B）-甲醇（C）；梯度洗脫為流速1 mL/min；進樣量10μL；二極管陣列檢測器（DAD），設(shè)定波長254 nm和270 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 二級蒸餾對竹醋液抑菌效果的影響

竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液的抑菌效果的比較結(jié)果見表 1.由表 1可見，竹醋液對E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A.niger均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且其中一級蒸餾液的抑菌效果均優(yōu)于二級蒸餾液.與一級蒸餾液相比，二級蒸餾液對E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A. niger的抑菌圈直徑分別減小了31.48%，15.38%，34.78%，47.62%，50.85%，表明將竹醋液二級蒸餾可降低其抑菌效果.

2.2 二級蒸餾對竹醋液殺菌效果的影響

表2比較了竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液對5種指示菌的致死濃度.結(jié)果表明，兩種竹醋液對液體培養(yǎng)的E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A.niger均表現(xiàn)出較強的抑制作用，濃度為25%及以上的竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液可完全抑制5種受試菌的生長.此外，由竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液再鋪板結(jié)果可知，兩種竹醋液對E.coli及C.albicans的最低殺菌濃度均為5%.而竹醋一級蒸餾液對P.aeruginosa、S.aureas及A.niger的最低殺菌濃度均低于二級蒸餾液.可以看出二次蒸餾處理促進竹醋的最低殺菌濃度升高.

表1 2種竹醋液的抑菌效果比較Tab.1 Comparison of antimicrobial effects of two bamboo vinegars

表2 竹醋液對5種供試菌的致死濃度Tab.2 Lethal concentration of two bamboo vinegars against variousmicroorganisms

2.3 二級蒸餾對竹醋液抗氧化能力的影響

表3對竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液抗氧化能力進行了比較.結(jié)果表明，與一級蒸餾液相比，竹醋二級蒸餾液的DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力、超氧陰離子清除能力、總還原能力分別下降了64.48%，94.66%，59.92%，90.46%.而竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液的經(jīng)自由基清除能力并無明顯差異.

表3 2種竹醋液的抗氧化能力比較Tab.3 Comparison of antioxidant activities of two bamboo vinegarsU·mL-1

2.4 二級蒸餾對竹醋液總酚、總黃酮含量的影響

表4對竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液中總酚，總黃酮含量進行了比較.結(jié)果表明，竹醋一級蒸餾液中的總酚、總黃酮質(zhì)量濃度分別為60.23μg/mL 和93.59μg/m L，而二級蒸餾液中的總酚、總黃酮質(zhì)量濃度僅為21.91μg/mL和4.41μg/mL，分別減少了63.62%和95.29%.

表4 2種竹醋液中總酚和總黃酮含量的比較Tab.4 Comparison of contents of total phenolic compounds and total flavones in two bamboo vinegars

2.5 二級蒸餾對竹醋液功效成分的影響

取竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液樣品分別進行HPLC指紋圖譜分析，測定兩種樣品在254 nm和270 nm波長下的吸收峰，見表5.結(jié)果表明，竹醋一級蒸餾液樣品在254 nm波長下通過分析獲得22個吸收峰，在270 nm波長下得到27個吸收峰.而竹醋二級蒸餾液樣品在254 nm下僅獲得1#、4#、7#、9#和13#5個吸收峰，這5個峰峰面積分別為875.7，393.8，64.0，46.7，34.0 mAU·s，均顯著低于一級蒸餾液吸收峰面積.此外竹醋二級蒸餾液樣品在270 nm下僅獲得1#、6#、11#、12#和15#5個吸收峰，峰面積分別為 182.1，1 048.7，130.9，26.7，77.4 mAU·s，與竹醋一級蒸餾液相比，二級蒸餾液峰面積值分別降低了63.52%，29.79%，75.61%，92.74%，86.46%.以上結(jié)果表明，二級蒸餾過程將造成竹醋液中酚類及黃酮類等功效活性成分的損失.

表5 2種竹醋樣品在254，270 nm下的吸收峰面積Tab.5 Area of absorption peaks at 254 nm and 270 nm of two bamboo vinegars

3 討 論

竹醋液是一種廣譜抑菌劑，對包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌在內(nèi)的5種指示菌的生長均具有良好的抑制效果，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在25%以上兩種竹醋液均可完全抑制5種指示菌的生長.常雅寧等［16］研究發(fā)現(xiàn)，竹醋液對黃曲霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制殺滅作用.李忠琴等［17］測定了竹醋對食品和水果中不同類型腐敗菌的抑制效果，結(jié)果顯示，竹醋液對細(xì)菌和真菌均具有較強的抑制作用，與本實驗結(jié)論一致.同時，本研究的結(jié)果表明，竹醋液具有較強的清除DPPH自由基、經(jīng)自由基、超氧陰離子能力及還原能力，并含有豐富的酚類及黃酮類抗氧化活性成分，因此具有良好的抗氧化效果.常雅寧等［6］的研究也表明竹醋液在清除氧自由基和油脂抗氧化方面具有良好性能.

本研究還發(fā)現(xiàn)，與一次蒸餾后的竹醋液相比，二次蒸餾后竹醋液對5種受試菌的抑菌殺菌效果明顯降低，同時最小殺菌濃度也相應(yīng)升高，且二次蒸餾后竹醋液的抗氧化能力降低，總酚類和總黃酮類的含量及種類減少.黃酮及多酚在植物中廣泛存在，多具顏色，由黃色至棕紅色不等.經(jīng)二次蒸餾后，竹醋液顏色更為清亮，推測可能與總酚、總黃酮的流失有關(guān).作為重要的植物次生代謝產(chǎn)物，多酚和黃酮是許多植物的功效組分，具有很強抗氧化和清除自由基作用［18-19］及消炎［20］、抗菌［21-22］、抗腫瘤［23］活性.因此二次蒸餾后竹醋液的抑菌活性、抗氧化活性受損可能與其總酚、總黃酮含量的降低密切相關(guān)，但是否為其主要原因還有待進一步研究.且竹醋中酚類和黃酮類物質(zhì)種類繁多，其中影響竹醋抑菌活性及抗氧化活性的主要成分也需要繼續(xù)探討.

二次蒸餾后竹醋樣品中酚類、黃酮類吸收峰的面積和數(shù)量均顯著降低，說明二次蒸餾不僅會降低竹醋中酚類、黃酮類的含量還會影響其種類.張文標(biāo)等［24］采用GC-MS對竹醋液進行組分分析發(fā)現(xiàn)，竹醋液含有有機酸、酚類、酮類、醇類、醛類等80多種主要物質(zhì).莊曉偉等［25］利用GC-MS分析比較竹醋液及精制液中各組分含量的差異，發(fā)現(xiàn)竹醋液原液的酚類、醛類、酮類物質(zhì)比精制竹醋液高44.6% 和10.6%，與本實驗結(jié)果相符.因此，在加工過程中，在盡量消除竹醋液不良風(fēng)味的同時，保持竹醋液原有的功效組分并提高其抗氧化活性及抑菌活性，使其在天然植物源殺菌劑與功能性食品及食品添加劑開發(fā)中得到更好應(yīng)用，仍需要進一步探討.此外，如何排除在竹醋液蒸餾制備過程中可能產(chǎn)生的毒害物質(zhì)，如某些醛類及醇類物質(zhì)等，使其得到更好的應(yīng)用，需要在下一步實驗中深入研究.

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Effect of Secondary Distillation on Antim icrobial and Antioxidant Activities of Bamboo Vinegar

AN Lin1， ZHANG Yan1， CUIYu2， WANG You-sheng1，*
（1.School of Food and Chemical Engineering/Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry/ Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；
2.Jiangyin China Grand Biotechnology Co.Ltd.，Jiangyin 214400，China）

The antimicrobialactivities，free radical scavenging capacity，the contentof totalphenols，and total flavonoids of primary and secondary distilled bamboo vinegarwere investigated.In addition，the primary and secondary distillation bamboo vinegarwasanalyzed for themain bioactive compounds by HPLC. The results indicated that the bamboo vinegar displayed strong antimicrobial activities againstEscherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，andCanidia albicansandAspergillus niger，and free radical-scavenging properties.However，antioxidant capacity and antimicrobial activities of secondary distilled bamboo vinegar were significantly lower than these of primary distilled bamboo vinegar.The HPLC fingerprint showed that the peak numbers and areas of secondary distilled bamboo vinegar at 254 nm and 270 nm were obviously lower than these of primary distilled bamboo vinegar.

bamboo vinegar；distillation；antimicrobial；antioxidant；HPLC

葉紅波）

TS205；S201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.007

2095-6002（2014）01-0034-06

安琳，張燕，崔宇，等.二級蒸餾對竹醋液抑菌與抗氧化效果的影響.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2014，32（1）：34-39. AN Lin，ZHANG Yan，CUIYu，et al.Effect of secondary distillation on antimicrobial and antioxidant activities of bamboo vinegar.Journal of Food Science and Technology，2014，32（1）：34-39.

2013-05-09

北京市屬高等學(xué)校人才強教計劃資助項目（PHR201108082）；2012年國家創(chuàng)新基金資助項目（12C26213202444）.

安 琳，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)；*王友升，男，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.通訊作者.