蔡維維，施建軍，馮 磊，杜 斌，邱麗穎，*

1江南大學(xué)藥學(xué)院;2江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，無錫 214122

合歡皮為豆科植物合歡(Albizia julibrissin Durazz.)的干燥樹皮，具有解郁安神、活血消腫的作用，用于心神不安，憂郁失眠，跌撲傷痛［1］。近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮還具有抗生育、抗過敏、抗腫瘤、免疫增強、鎮(zhèn)靜安神等作用［2］。研究室前期研究已發(fā)現(xiàn)，合歡皮的乙醇提取物-正丁醇萃取組分(簡稱:合歡皮正丁醇相)是合歡皮中抑制腫瘤血管新生的有效部位［3］，經(jīng)鑒定其活性組分群為皂苷類物質(zhì)［4］。本研究擬建立SPE-HPLC 快速分離法，從合歡皮正丁醇相中分離得到抗血管新生活性高并且組成簡單的有效部位，以替代傳統(tǒng)的大孔樹脂洗脫、薄層色譜分離等常規(guī)分離方法，為下一步分離得到活性單體提供合歡皮活性組分提取物。

1 儀器與材料

DIONEX Ultimate-3000 型液相色譜儀(戴安中國有限公司);R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)。InnovationTMHLB Cartridge 固相萃取柱(60 mg，3 mL)、InnovationTMRTP Amide 制備色譜柱(21.2 mm ×250 mm，10 μm)和InnovationTMRTP Amide 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，10 μm)均為無錫科奧美萃生物科技有限公司產(chǎn)品。

合歡皮產(chǎn)于浙江，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳健偉教授鑒定為Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮。MCDB 131 細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco BRL 公司);胰蛋白酶、小牛血清和L-谷氨酰胺(華美生物工程公司);磺酰羅丹明B(SRB)和表皮生長因子(EGF)(美國Sigma 公司);甲醇、乙腈為色譜純，乙醇、正丁醇等均為分析純，水為去離子水。

細(xì)胞株為SV40 病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)傳代株，由法國國家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院U553 研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈，保存于液氮灌中。

2 方法與結(jié)果

2.1 合歡皮正丁醇相的制備

稱取合歡皮100 g 置2 L 圓底燒瓶中，加入75%乙醇1 L 加熱回流兩次，每次2～2.5 h，冷卻后合并提取液，過濾。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以水復(fù)溶至400 mL，用等體積水飽和正丁醇萃取至正丁醇相無色，合并正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再用水復(fù)溶，置60 ℃真空干燥箱中干燥，得黃棕色無定形粉末狀合歡皮正丁醇相樣品，具有吸濕性和辛辣味，干粉得率為3.92%。

2.2 固相萃取法分離合歡皮正丁醇相樣品

精密稱取合歡皮正丁醇相干粉20 mg，加水制成濃度為2 mg/mL 的溶液。取InnovationTMHLB Cartridge 固相萃取柱，用甲醇、超純水活化。然后取樣品溶液3 mL 進(jìn)行分離，流速為1 mL/min，先用3倍體積的超純水進(jìn)行沖洗，然后再分別用3 倍體積的50%甲醇和100% 甲醇洗脫，收集洗脫液，將50%甲醇洗脫部分記為組分I，100%甲醇洗脫部分記為組分II，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加水復(fù)溶，真空干燥，計算得組分I 和II 的干粉得率為40.7% 和49.25%。

2.3 RTP Amide 制備柱分離制備合歡皮有效部位

精密稱取組分II 50 mg，加水定容至10 mL，得5 mg/mL 的供試品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。按以下色譜條件分離制備:色譜柱InnovationTMRTP Amide 制備色譜柱(21.2 mm ×250 mm，10 μm);流動相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫:0～2 min，0%(A);2～35 min，0%～25% (A);35～50 min，25%～40% (A)，50～60 min，40%～100%(A);流速:10 mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:0.5 mL。在5 個不同的時間段收集樣品，分別記為組分II-1～5，并計算得各組分得率分別為 15.13%、17.06%、11.63%、34.88% 和9.31%。

2.4 細(xì)胞活性評價

分別精密稱取組分I、組分II 和組分II-1～5 干粉各2 mg，用MCDB131 培養(yǎng)基溶解，得1 mg/mL 母液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

將HMEC-1 細(xì)胞正常培養(yǎng)，至細(xì)胞消化前1 d換含2%小牛血清的培養(yǎng)基使之同步化。消化細(xì)胞，計數(shù)，按每孔8000 個細(xì)胞鋪96 孔板，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中24 h，再加入不同濃度的各組分溶液，設(shè)陰性對照組(即不加藥組)，每組設(shè)4 個復(fù)孔，重復(fù)試驗3 次。48 h 后取出96 孔板，棄去上清液，每孔加入100 mg/mL 三氯乙酸(TCA)200 μL后置4 ℃冰箱40 min，倒去TCA 后用水沖洗4 遍，晾干;各孔再加入4 mg/mL SRB 溶液100 μL 于37℃放置30 min，倒去SRB 溶液，再用水洗4 遍，各孔再加入10 mmol/L Tris 堿液(pH 10.5)150 μL 充分溶解，在540 nm 波長處測各孔吸光度值(D)，按下式計算各組分的抑制率(inhibition rate，IR)及IC50值。

表1 不同組分對HMEC-1 細(xì)胞的抑制率(n=3，)Table 1 Inhibition rates of different components of A.julibrissin on HMEC-1 cells (n=3，)

表1 不同組分對HMEC-1 細(xì)胞的抑制率(n=3，)Table 1 Inhibition rates of different components of A.julibrissin on HMEC-1 cells (n=3，)

注:“-”表示此濃度下的組分對HMEC 細(xì)胞沒有抑制作用;“n.d.”表示無法確定。Note:“-”means no inhibitory effect on HMEC cells at that concentration;“n.d.”means not determined.

依據(jù)不同組分對HMEC-1 細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果見表1。結(jié)果表明組分II 的活性比組分I 更佳，組分II 的IC50為(11.58 ±0.09)μg/mL。實驗證明固相萃取法中100%甲醇溶液洗脫能有效地富集合歡皮的活性部位。因此，將組分II 作為制備色譜柱分離的原料。HMEC-1 細(xì)胞抑制實驗結(jié)果也表明了組分II-1、組分II-2 和組分II-5 沒有抑制細(xì)胞生長的活性，組分II-3(IC50為6.15 ±0.08 μg/mL)與組分II-4(IC50為1.45 ±0.11 μg/mL)均表現(xiàn)有一定的抑制作用，且組分II-4 的抑制作用更明顯。

2.5 樣品溶液的HPLC 分析

分別取合歡皮正丁醇相、組分I、組分II 及組分II-4 干粉各10 mg，用水溶解，定容至10 mL，得1 mg/mL 供試品溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。按以下色譜條件進(jìn)行分析，色譜柱:InnovationTMRTP Amide 液相色譜柱(4.6 mm × 250 mm，10 μm);流動相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫:0～5 min，0%(A);5～35 min，0%～25%(A);35～50 min，25%～40%(A);50～60 min，40%～100%(A);流速:1.0 mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL。

比較合歡皮正丁醇相、組分I、組分II 的分析色譜圖(圖1A、B、C)，HLB 固相萃取柱能將合歡皮正丁醇相分為兩部分，且組分I 為合歡皮正丁醇相的10～40 min 部分，組分II 為其40～60 min 部分。

圖1 各組分樣品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of A.julibrissin ethanol reflux-n-butanol extract (A)，component I (B)，component II (C)and component II-4 (D)

分析組分II-4 的HPLC 色譜圖(圖1D)發(fā)現(xiàn)，組分II-4 的組成簡單，物質(zhì)主要集中在50～52 min內(nèi)，且峰形較好，雖然在本HPLC 分析條件下各個組分色譜峰的分離度沒有達(dá)到制備分離的要求，但可以在此基礎(chǔ)上，通過改變色譜條件，分離得到活性單體，這也為后期合歡皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供實驗依據(jù)。因此本研究將組分II-4 定為抑制血管新生活性較好的最佳組分，作為后期分離單體的合歡皮活性組分提取物。

3 討論

傳統(tǒng)的分離技術(shù)(如大孔樹脂洗脫、薄層色譜分離等)存在工作量大、耗時長等缺點，因此需要尋求一種高效快速的分離方法以替代傳統(tǒng)的分離技術(shù)。InnovationTMHLB Cartridge 固相萃取柱是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的超低壓快速反相層析填料，它的基架為大小均一的堅硬的聚苯乙烯分子，適用于天然產(chǎn)物的分離純化［5］以及環(huán)境水資源、生物樣品的分析［6，7］。這種HLB 填料還可用于其他極性或非極性化合物的提取、富集和凈化。InnovationTMRTP Amide 是酰胺極性嵌入式鍵合相，這種鍵合相的選擇性獨特，一些在C18鍵合相上分離困難的物質(zhì)，可以在極性嵌入式鍵合相上獲得很好的解決。它是在類似C18鏈長度的硅烷試劑中嵌入極性酰胺，使得鍵合相親水，在100%水相條件下穩(wěn)定。由于本研究中的合歡皮皂苷極性較大，實驗結(jié)果證明使用HLB 固相萃取柱可以很好的分離合歡皮正丁醇相，富集得到合歡皮的有效部位。實驗還發(fā)現(xiàn)，合歡皮正丁醇相在InnovationTMRTP Amide 液相色譜柱上的分離度較好，一些主要的有效物質(zhì)峰，例如組分II-4 能夠被分離開，作為下一步分離有效單體的合歡皮活性組分提取物。

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