王 硯，王書林

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137;2 四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 611731

我國柴胡屬植物分布廣，種類多，有36 種、17變種、7 變型，但《中國藥典》2010 年版僅收載了北柴胡(Bupleurumchinense DC.)和狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)兩個來源［1］，其資源遠遠不能滿足市場需求。竹葉柴胡(Bupleurummarginatum Wall.exDC.)在中國西南地區(qū)分布廣泛，具有悠久的用藥歷史，是目前市場上柴胡藥材的主要來源之一，但并非為藥典正品柴胡，故不能作為柴胡藥材在制劑生產(chǎn)中投料，在市場應(yīng)用上受到一定限制。本文選擇竹葉柴胡(B.marginatumWall.exDC.)進行研究，首先利用中國藥典正品柴胡樣品(北柴胡)建立標準指紋圖譜，將其與標準指紋圖譜進行相似度比較，以評估其內(nèi)在質(zhì)量，考察其作為柴胡資源補充的可能性。同時增加其他幾種基源如馬尾柴胡(B.microcephalum Diels.)、馬爾康柴胡(B.malconense Shan et Y.Li.)、抱莖柴胡(Bupleurumlongicaule var.amplexicaule C.Y.Wu)，通過相似度結(jié)果評價不同基源的柴胡質(zhì)量的一致性和差異性，再進行聚類分析，考察各不同基源柴胡親緣關(guān)系，驗證聚類分析方法作為基源鑒定的可行性，為柴胡基源鑒定提供科學(xué)依據(jù)，并可用于選育優(yōu)質(zhì)的柴胡品種。

據(jù)報道，竹葉柴胡的化學(xué)成分主要為五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，含量較高的為柴胡皂苷a、c、d［2］，現(xiàn)代藥理研究表明柴胡皂苷具有解熱、抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及鎮(zhèn)靜、抗驚厥等多方面藥理活性［3-6］?！吨袊幍洹?010 年版柴胡項下鑒別和含量測定成分為柴胡皂苷a、d，功能與主治為疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣。竹葉柴胡的化學(xué)指標成分及藥理作用跟藥典正品柴胡具有一致性，但竹葉柴胡習(xí)慣以全草入藥，目前對于竹葉柴胡的研究亦均為全草，而藥典收載的柴胡品種以根入藥，故對竹葉柴胡根部的化學(xué)成分研究缺乏針對性。故本文所用樣品均為干燥根部分，著力于闡明竹葉柴胡與北柴胡干燥根在內(nèi)在成分上的相關(guān)性以及竹葉柴胡作為藥典正品柴胡的補充資源的可行性。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

不同基源柴胡藥材于2011～2013 年期間8 月～9 月采自四川省榮縣、綿陽、阿壩州地區(qū)、河北承德和陜西鳳縣，共13 份，編號、基源見表1。供建立標準指紋圖譜的北柴胡樣品于2011～2013 年期間8 月～9 月采自河北涉縣、綿陽青川、河北承德、陜西鳳縣四川劍閣和河北安國，共10 份，編號、基源見表2。以上樣品均由四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成主任藥師鑒定。

表1 柴胡藥材樣品Table 1 Information of Bupleurum samples investigated in this study

表2 建立標準指紋圖譜的北柴胡藥材樣品Table 2 Information of B.chinense DC.samples for standard fingerprinting

柴胡皂苷A(批號:110777-201108)、柴胡皂苷D(批號:110778-201208)對照品均來源于中國藥品生物制品檢定所;柴胡皂苷B2(批號:12041002)、柴胡皂苷C(批號:12091701)對照品來源于通羅馬科技有限公司。乙腈，色譜純，購自Fisher 公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀-Waters2487 紫外檢測器(美國Waters 公司)，Empower 工作站;FB11207 超聲處理儀(Fisherbrand);150 搖擺式粉碎機(浙江瑞安永歷制藥機械有限公司);CPA2250 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);SEG-021H高溫試驗箱(上海愛斯佩克環(huán)境設(shè)備有限公司)

2 實驗方法

2.1 供試品溶液和對照品溶液的制備

分別精密稱取適量柴胡皂苷A、B2、C、D 對照品，置10 mL 容量瓶中，用適量甲醇溶解后定容至刻度并搖勻，分別制成濃度為1.04、0.62、0.68 和1.04 mg/mL 的混合對照品溶液。

稱取樣品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，用甲醇20 mL 分2 次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 HPLC-UV 分析條件

色譜柱:Welch C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)和水(B);梯度洗脫條件為0～50 min，25%～90%A;檢測波長為210 nm;柱溫35 ℃;流速為0.8 mL/min;進樣量為10 μL。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 精密度試驗

取2.1 中供試品溶液在2.2 液相色譜條件下，連續(xù)進樣5 次，測定各共有色譜峰的保留時間和峰面積，以柴胡皂苷D 為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果表明相對保留時間RSD在0.045%～0.98%，相對峰面積的RSD 在0.28%～1.11%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取2.1 中供試品溶液分別于制備后0、8、16、24、48 h 進樣，測定各共有峰的保留時間和峰面積，以柴胡皂苷D 為參照峰，計算相對保留時間和峰面積的RSD 值，結(jié)果表明相對保留時間RSD 為0.056%～1.22%，相對峰面積的RSD 在0.98%～2.65%，說明樣品在48h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取S1 樣品5 份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進樣，測定各共有峰的保留時間和峰面積，以柴胡皂苷A 為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積的RSD 值，結(jié)果表明相對保留時間RSD 為0.033%～2.01%，相對峰面積的RSD 為1.08%～2.39%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4 樣品分析

將表1 中18 批柴胡樣品按2.1 項下方法制備所得供試液按2.2 項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，同時定位柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C 和柴胡皂苷D。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將表2 中10 批北柴胡樣品(分別采自陜西鳳縣、河北涉縣、河北承德、綿陽青川和河北安國)HPLC 色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，生成北柴胡對照圖譜。再以北柴胡對照圖譜為參照圖譜，將表1 中13 批柴胡樣品HPLC 色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，計算相似度。

以共有峰峰面積為變量，運用SPSS 18.0 軟件對各樣品進行聚類分析，得出樹形圖。

3 實驗結(jié)果

3.1 北柴胡標準指紋圖譜的建立

按2.2 項下色譜條件對表2 中北柴胡樣品進行檢測，記錄色譜圖50 min 并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004》，進行色譜峰匹配，匹配數(shù)據(jù)顯示14 個峰是所有樣品共有的，按出峰時間依次標定為1～14 號峰。見圖1。通過與對照品圖譜比較鑒定，第3、6、9 號峰分別為柴胡皂苷C、柴胡皂苷A 和柴胡皂苷D，未檢出柴胡皂苷B2，選擇6 號峰為參照峰。

圖1 北柴胡HPLC 對照指紋圖譜Fig.1 HPLC chromatogramofB.chinense

3.2 指紋圖譜的相似度計算

按照國家藥典委員會公布的中藥指紋圖譜評價軟件計算方法，得到各批次柴胡的HPLC 指紋圖譜相似度結(jié)果見表2，各批次柴胡樣品色譜重疊圖見圖2。從表2 可知，13 批柴胡樣品的相似度均高于0.8，與藥典正品北柴胡相比較，不同基源的柴胡均具有較高的相似性。其中8 批栽培竹葉柴胡相似度在0.877～0.925 之間，兩批野生品種相似度分別為0.941 和0.932，因此同基源藥材由于生長環(huán)境不同，指紋圖譜相似度也有所差異，野生竹葉柴胡相似度高于栽培竹葉柴胡，10 批竹葉柴胡平均相似度為0.908;馬爾康柴胡、馬尾柴胡相似度分別為0.915和0.900，說明同為川產(chǎn)道地品種的柴胡與竹葉柴胡化學(xué)成分相似度高，基源上較為接近;抱莖柴胡為0.858;

相似度從高到低依次為:竹葉柴胡＞馬爾康柴胡＞馬尾柴胡＞抱莖柴胡。結(jié)果顯示，竹葉柴胡與北柴胡化學(xué)成分具有較高一致性，并且質(zhì)量穩(wěn)定可控。

3.3 聚類分析

根據(jù)各色譜峰的峰面積進行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖3。由以下樹狀圖可以看出，聚類距離為1 時S12、S13、S1、S10、S11、S8、S9、S6、S7、S5 聚為一類均為竹葉柴胡，S2(馬爾康柴胡)、S4(馬尾柴胡)在聚類距離為2 時聚為一類，聚類距離為3 時再與S3(抱莖柴胡)聚為一類，聚類距離為4 時與竹葉柴胡聚為一類，說明馬爾康柴胡、馬尾柴胡、抱莖柴胡與竹葉柴胡基源相近。B9、B10、B4、B6、B7 在聚類距離為1 是聚為一類，均為采自陜西鳳縣的北柴胡，B1、B8 為采自河北的北柴胡栽培品種，在聚類距離為2 時聚為一類，再與B2、B5、B3 分別在聚類距離為5、7、12 時聚為一類，北柴胡采收地點相差較大，說明不同的生長環(huán)境會導(dǎo)致化學(xué)成分的差異較大。

表3 柴胡藥材樣品HPLC 指紋圖譜的相似度結(jié)果Table 3 Similarities of Bupleurum samples

圖2 柴胡藥材樣品HPLC 色譜重疊圖Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of Bupleurum samples

圖3 柴胡屬植物的聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of Bupleurum samples

4 討論

從指紋圖譜分析來看，13 批柴胡樣品相似度結(jié)果均高于0.8，竹葉柴胡樣品相似度平均為0.908，說明竹葉柴胡與藥典正品北柴胡物質(zhì)基礎(chǔ)相近，且質(zhì)量可控。竹葉柴胡可作為優(yōu)質(zhì)柴胡資源進一步研究，以補充藥典收載的品種基源。

聚類分析的結(jié)果顯示竹葉柴胡聚為一類，馬爾康柴胡與馬尾柴胡聚為一類，抱莖柴胡聚為一類，以上三種川產(chǎn)柴胡與竹葉柴胡基源最為接近，北柴胡聚為一類。聚類分析與傳統(tǒng)基源分類結(jié)果一致，因此聚類分析能夠?qū)Σ煌吹牟窈M行分類鑒定。

柴胡屬植物種類多，變種、變型多，紛繁復(fù)雜，傳統(tǒng)基源鑒別主要依賴植物的地上部分形態(tài)特征，對于僅使用根部的柴胡藥材，鑒別其藥材及飲片難度較大。使用HPLC 指紋圖譜可全面地得到柴胡藥材的皂苷類成分化學(xué)信息，并利用這些化學(xué)信息可對其進行相似度計算進行有效的質(zhì)量控制。再結(jié)合聚類分方法，可從基源上篩選優(yōu)質(zhì)可靠的柴胡品種進行培育，緩解藥典正品柴胡供不應(yīng)求的市場壓力。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of People’s Republic of China(中華人民共和國中國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，263-264.

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