李維峰，宋啟示，項(xiàng) 偉，王婭玲

1云南熱帶作物職業(yè)學(xué)院，普洱 665000;2 中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223

廣州蛇根草為茜草科Rubiaceae 蛇根草屬植物Ophiorrhiza cantoniensis Hance 的全草，主要分布于云南、廣州、海南、廣西、貴州等地?！吨兴幋筠o典》記載:蛇根草(日本蛇根草)具有“活血化淤。治療治咳嗽、勞傷吐血，跌打，月經(jīng)不調(diào)”的功效。目前對(duì)于蛇根草屬植物化學(xué)成分的研究比較少，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)有對(duì)蛇根草、日本蛇根草等化學(xué)成分研究的報(bào)道［1-4］，研究發(fā)現(xiàn)該屬植物含有主要藥用成分為喜樹(shù)堿、10-甲氧基喜樹(shù)堿、谷甾醇和麥角甾醇等化合物［5］。

為了探明廣州蛇根草有效成分及其抗菌活性，筆者對(duì)其全草進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離到了3 個(gè)化合物，分別鑒定為:β-谷甾醇(1)、β-胡蘿卜苷(2)、喜果苷(3)。其中化合物1、2、3 均為首次從該植物中得到;并且采用濾紙片法對(duì)廣州蛇根草乙醇提取物的不同極性萃取部分和上述三種化合物進(jìn)行了抗菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其乙醇提取物的石油醚萃取部分和氯仿萃取部分具有較強(qiáng)的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

廣州蛇根草樣品采集于云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園植物標(biāo)本室鑒定為茜草科植物廣州蛇根草(Ophiorrhiza cantoniensis Hance)帶花全草。樣品標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園民族藥與功能食品組。

1.2 儀器

熔點(diǎn)在SGW X-4 顯微熔點(diǎn)儀上測(cè)定(溫度計(jì)未校正);核磁共振譜用Bruker AM-400、DRX-500 測(cè)定，TMS 為內(nèi)標(biāo);質(zhì)譜用英國(guó)VG 公司VG-AutoSpec-3000 型測(cè)定;柱層析硅膠(200～300 目)、薄層硅膠板(50 mm×100 mm)均為青島海洋化工廠生產(chǎn);大孔樹(shù)脂DM-130 由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn);反向材料使用MCI。無(wú)菌操作臺(tái)(上海凌初環(huán)保儀器有限公司公司)，智能光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)，壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠)，純水機(jī)(北京普析)。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

供試菌株包括真菌和細(xì)菌兩大類(lèi)，其中細(xì)菌有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtlis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃八疊球菌(Sarcina ureae);真菌有白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、清酒酵母菌(Saccharomyces sake)(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)培養(yǎng)，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。

PDA 培養(yǎng)基:用去皮馬鈴薯200 g 切成薄片煮沸30 min，然后用紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20 g 及瓊脂15 g，補(bǔ)水至1000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000 mL，瓊脂15 g，混合后調(diào)PH 值至7.0～7.2。

1.4 蛇根草化學(xué)成分的提取與分離

廣州蛇根草全草2.85 kg，粉碎后采用浸漬法用95%乙醇于室溫下提取3 次，每次浸泡24 h。合并提取液，過(guò)濾，減壓濃縮、蒸干得到乙醇浸膏285.5 g，浸膏用5 倍量的水分散均勻后依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，每種溶劑各萃取4 次，得到石油醚萃取物42 g，氯仿萃取物27.9 g，正丁醇萃取物140 g，此外還有剩余的水溶部分。石油醚部分以三倍量硅膠(100 目)拌樣后以1.2 kg(200～300)目硅膠柱層析，石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫(1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，0∶1)，從而得到化合物1(3.2 g)。

氯仿萃取物以三倍量硅膠(100 目)拌樣以后以900 g 硅膠(200～300 目)柱層析，石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫(1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，0∶1)，從而得到化合物2(0.15 g)。

正丁醇萃取物用水溶解之后上大孔樹(shù)脂柱分段，水-甲醇混合溶劑梯度洗脫(8∶2，7∶3，0∶1);其中水:甲醇=7:3 洗脫劑沖下部分上反向MCI 進(jìn)行柱層析。從而得到化合物3(0.35 g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分鑒定

化合物1 C29H50O，M414，無(wú)色片狀結(jié)晶(丙酮)，mp.137～139 ℃，Lieberman-Buchard 反應(yīng)(醋酐-濃硫酸反應(yīng))顯紫紅色后迅速變?yōu)榫G色，Salkowski 反應(yīng)(濃硫酸-氯仿反應(yīng))呈陽(yáng)性;1H NMR(500 MHz，CDCl3)譜顯示有δ5.28(1H，d，J=5.1 Hz，6-H)烯氫信號(hào)和δ3.45(1H，m，3-αH)連氧碳上的氫信號(hào)，δ0.94(3H，s，19CH3)和δ0.61(3H，s，18CH3)為角甲基上的氫信號(hào)，δ0.85(3H，d，J=6.3 Hz)，δ0.78(3H，t，J=6.8 Hz)，δ0.77(3H，d，J=6.6 Hz)為甲基上的信號(hào);該化合物與β-谷甾醇對(duì)照品共進(jìn)行薄層層析，石油醚:乙酸乙酯(4∶1)和石油醚:乙醚(2∶1)展開(kāi)，Rf值一致，以上信息及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致［6，7］，確定該化合物為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物2 C35H60O6，M576，白色無(wú)定形粉末(MeOH)，mp.281～282 ℃，Lieberman-Buchard 反應(yīng)(醋酐-濃硫酸反應(yīng))陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性，1H NMR(500 MHz，DMSO)譜有δ5.29(1H，brs，6-H)烯氫信號(hào)，δ4.18(1H，d，J=7.2 Hz)糖基端上氫信號(hào)，呈β構(gòu)型，δ:2.84～δ4.20 范圍內(nèi)存在糖基上的多個(gè)質(zhì)子。δ:0.99 (3H，s，19CH3)和δ:0.63 (3H，s，18CH3)為角甲基上的氫信號(hào)，δ:0.88(3H，d，J=6.3 Hz)，δ:0.86 (3H，t，J=6.0 Hz)，δ:0.81(3H，d，J=5.4 Hz)和δ:0.79 (3H，d，J=6.0 Hz)為甲基上的氫信號(hào);13C NMR(500 MHz，DMSO)δ:27.94(t，C-2)，73.46(d，C-3)，42.3(t，C-4)，140.46(s，C-5)，121.16(d，C-6)，31.42(t，C-7)，31.42(d，C-8)，49.62(d，C-9)，36.51(s，C-10)，20.59(t，C-11)，39.85(t，C-12)，41.85(s，C-13)，56.18(d，C-14)，24.33(t，C-15)，29.26(t，C-16)，55.45(d，C-17)，11.65(q，C-18)，19.07(q，C-19)，36.15(d，C-20)，18.61(q，C-21)，33.94(t，C-22)，25.42(t，C-23)，45.85(d，C-24)，29.16(d，C-25)，18.93(q，C-26)，19.68(q，C-27)，22.51(t，C-28)，11.77(q，C-29)，100.82(d，C-1')，76.98(d，C-2')，76.77(d，C-3')，76.71(d，C-4')，73.46(d，C-5')，61.10(t，C-6')。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道對(duì)照，確定該化合物為β-胡蘿卜苷(daucosterol)。

化合物3 C26H30N2O8，M498，無(wú)色針狀結(jié)晶(MeOH)，mp.201～202 ℃，1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:7.55(1H，d，J=7.9 Hz，H-9)，7.28(1H，m，H-17)，7.24(1H，d，J=7.9 Hz，H-12)，4.71(1H，d，J=7.9 Hz，H-1')，2.71(2H，m，H-20)，2.33(1H，dt，J=13.2，3.8 Hz，H-14b)，2.86(2H，m，H-6a，b)，13C NMR(C5D5N，400 MHz)δ:170.34(s，C-22)，150.68(d，C-17)，135.55(s，C-2)，133.78(d，C-19)，133.54(s，C-13)，125.98(s，C-8)，122.00(d，C-11)，119.96(d，C-10)，117.61(d，C-9)，116.21(t，C-18)，111.33(s，C-7)，110.09(d，C-12)，105.74(s，C-16)，98.92(d，C-1')，94.58(d，C-21)，77.18(d，C-3')，76.58(d，C-5')，72.95(d，C-2')，69.69(d，C-4')，60.91(t，C-6')，48.96(d，C-3)，43.34(d，C-20)，40.05(t，C-5)，34.72(t，C-14)，31.10(d，C-15)，19.36(t，C-6)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9-11］報(bào)道對(duì)照，確定該化合物為喜果苷(長(zhǎng)春苷內(nèi)酰胺，vincoside-lactam，VCS-LT)。

2.2 抗菌活性測(cè)定

抗菌試驗(yàn)采用濾紙片法。預(yù)先把各種供試菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 斜面培養(yǎng)基分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行菌種活化，培養(yǎng)2～3 d 后各加入3 mL無(wú)菌水制成菌懸液備用。

將三張定性濾紙疊放，用打孔器打成若干直徑約為5.5 mm 的圓形濾紙片，滅菌后備用。

配制固體培養(yǎng)基，滅菌，待其溫度降至約50 ℃時(shí)，加入菌懸液，搖勻，倒平板，待平板凝固后用滅菌鑷子夾取濾紙片浸取待試樣品的二甲亞砜溶液貼在上述各種含菌培養(yǎng)基上，濾紙片在每個(gè)平板內(nèi)間隔一定距離，每個(gè)平板內(nèi)設(shè)浸有二甲基亞砜的濾紙片一枚作空白對(duì)照，用浸有1 U/mL(1U 單位，0.6 μg為1U 單位)、100 U/mL 兩種濃度的青霉素鈉溶液的濾紙片作陽(yáng)性對(duì)照，然后將各平板放入適宜的溫度培養(yǎng)(細(xì)菌于37 ℃，真菌于28 ℃)，24 h 后取出，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

廣州蛇根草樣品乙醇提取物的氯仿萃取部分對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌活性，石油醚萃取部分對(duì)金黃色葡萄球菌具有較弱的抑菌活性，水提物則無(wú)明顯抑菌活性，說(shuō)明其不含抑菌活性成分?；衔?(β-谷甾醇)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有中等抑制活性，但化合物2(β-胡蘿卜苷)、3(vincoside-lactam)則無(wú)明顯抑菌活性(表1)。供試樣品及對(duì)照試劑對(duì)真菌類(lèi)供試菌均未顯示出抗菌活性。

表1 廣州蛇根草各萃取物及單體化合物對(duì)細(xì)菌抑制試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 1 Inhibition of substances of Ophiorrhiza cantoniensis to bacteria

3 討論

從廣州蛇根草中得到的三種化合物，并在初提物中分離到大量的無(wú)機(jī)鹽。其中化合物3 為喜果苷(長(zhǎng)春苷內(nèi)酰胺，vincoside-lactam，VCS-LT)，且得到的量較大(0.35 g)，研究表明喜樹(shù)堿類(lèi)化合物和喜果苷均具有顯著抗白血病和抑制腫瘤活性［1］;前人報(bào)道中均為從喜樹(shù)的果實(shí)等部位提取喜果苷，筆者首次從廣州蛇根草中分離得到喜果苷，發(fā)現(xiàn)了新的喜果苷來(lái)源，對(duì)于開(kāi)拓新的抗癌藥物資源具有重要意義。

另外試驗(yàn)中還得到了大量的β-谷甾醇(3.2 g)和胡蘿卜苷(0.15 g)，說(shuō)明該種植物的主要藥效成分可能為喜果苷和β-谷甾醇等化合物［5］。

本試驗(yàn)從抑菌方面證實(shí)，廣州蛇根草氯仿部分和石油醚部分均含有抑菌活性物質(zhì)，而β-谷甾醇由石油醚萃取物中得到且量很大(3.2 g)，β-谷甾醇具有較強(qiáng)的抗菌活性［12］，則說(shuō)明該甾醇化合物可能為廣州蛇根草中主要的抑菌活性物質(zhì)，此化合物為脂溶性化合物，在水溶部分中含量極微或者不含該化合物，所以水溶部分顯示無(wú)抗菌活性。

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