李 馳 王忠利

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于老年男性。臨床技術(shù)手段的不斷進(jìn)步使原位癌及大部分轉(zhuǎn)移癌的切除已不存在技術(shù)問題，但術(shù)后癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥是導(dǎo)致前列腺癌患者死亡的主要原因［1-2］。目前缺乏治療晚期前列腺癌的有效手段，對前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制知之甚少，因此尋找抑制前列腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的重要分子靶點(diǎn)顯得尤為重要。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物普遍存在的在RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，是一種特異性失活功能基因的方法，已成為研究基因功能的重要工具［3-4］。該方法選擇性高，但不改變其他正?；虻墓δ?。本研究通過在前列腺癌PC3細(xì)胞株中特異性干涉沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1），探討下調(diào)SIRT1的表達(dá)對人前列腺癌PC3細(xì)胞系的細(xì)胞周期影響，分析前列腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，為SIRT1作為治療前列腺癌的一個潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SIRT1 siRNA和scramble siRNA（上海吉瑪公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；RPMI 1640/F12培養(yǎng)液（美國Corning公司）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Promega公司）；SIRT1抗體（美國Merck Millipore公司）；PRb抗體、P21、P27和β-actin抗體（美國Santacruz公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；MTT、Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Piece Biotechnology公司）。BB16UV CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Eppendorf公司）；Sunrise自動酶標(biāo)檢測儀（美國Tecan公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）；凝膠自動成像儀GDS8000、水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌PC3細(xì)胞系購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640/F12培養(yǎng)基，在飽和濕度、37℃和5%CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，以1×105/mL濃度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

1.2.2 SIRT1 siRNA的合成和轉(zhuǎn)染 針對人SIRT1的cDNA序列（GenBank No.NM_012238）尋找候選RNAi靶點(diǎn)序列，通過Blast同源性比對分析其基因特異性。SIRT1 siRNA序列正義鏈為5'-GAAGUUGACCUCCUCAUUGUdTdT-3'，反義鏈為 5'-ACAAUGAGGAGGUCAACUUCdTdT-3'［5］，由上海吉瑪公司純化合成。PC3細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分空白對照（Mock）組、發(fā)夾siRNA對照（scramble siRNA）組和SIRT1 siRNA 轉(zhuǎn) 染 組 。20 μ M scramble siRNA 或SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR方法檢測SIRT1 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol一步法提純各組PC3細(xì)胞中總RNA，并測定RNA濃度，當(dāng)A260/A280比值為1.9～2.0可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。SIRT1引物序列上游為5'-GACTCCAAGGCCACGGATAG-3'；下游為5'-GGAAGTCTACAGCAAGGCGA-3'，預(yù)期片段長度為335 bp。GAPDH引物序列上游為5'-CGGAGTCAACG GATTTGGTCGTAT-3'；下游為 5'-AGCCTTCTCCATG GTGGTGAAGAC-3'，長度為306 bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、55℃ 退火30 s、72℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸7 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

1.2.4 MTT方法檢測PC3細(xì)胞生長抑制率 取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種于96孔板培養(yǎng)板上，每組6個平行復(fù)孔。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h或48 h后，取出96孔板，在每孔中加入新鮮配制的20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入150 μL/孔二甲基亞砜（DMSO），振蕩15 min，充分溶解紫色結(jié)晶。酶標(biāo)儀測定490 nm吸光度值（A值），并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 SIRT1 siRNA或scramble siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞周期同步化。同步化的上述細(xì)胞種植于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶-EDTA消化離心細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞。在收集的細(xì)胞中加入100 μg/mL RNase A，室溫放置30 min。避光條件下加入10 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，室溫放置30 min后流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的DNA含量，計(jì)算細(xì)胞周期。

1.2.7 Western blot方法檢測SIRT1、P21、P27和Rb蛋白表達(dá) 取出各組細(xì)胞，蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后檢測。10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，使用含5%脫脂奶粉的TBS（pH為7.4）封閉濾膜2 h。再分別與SIRT1、PRb抗體（稀釋比為1:1 000），P21、P27抗體（稀釋比為1:200）及β-actin抗體（稀釋比為1:1 000）4℃溫育過夜。TTBS洗滌3次后，HRP偶聯(lián)的IgG（稀釋比為1:5 000）室溫溫育2 h，洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析的方法。P＜0.01為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞效率的驗(yàn)證

與Mock組和scramble siRNA組比較，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組明顯抑制PC3細(xì)胞內(nèi)源性SIRT1 mRNA水平和蛋白表達(dá)（圖1）。

2.2 下調(diào)SIRT1表達(dá)對PC3細(xì)胞體外增殖的影響

與Mock組和scramble siRNA組比較，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的生長增殖，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖1 PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of SIRT1 mRNA and protein in SIRT1 siRNA-transfected PC3 cells

圖2 MTT方法檢測轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后的PC3細(xì)胞增殖Figure 2 PC3 cell proliferation rate as evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium assays

2.3 干擾SIRT1表達(dá)對PC3細(xì)胞周期的影響

與Mock組［（45.49±1.89）%］和scramble siRNA組［（48.00±2.76）%］比較，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組PC3細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞所占比例增加［（63.73±2.86）%］（P＜0.01）；與Mock組［（27.60±1.13）%］和scramble siRNA組［（28.46±2.05）%］比較，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞所占比例減少［（13.77±2.09）%］（P＜0.01）。

2.4 干擾SIRT1表達(dá)對P21、P27細(xì)胞周期蛋白和Rb蛋白表達(dá)水平的影響

與Mock組和scramble siRNA組比較，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組降低P21和P27蛋白表達(dá)升高，Rb蛋白磷酸化表達(dá)降低（圖3）。

圖3 PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后P21、P27和Rb蛋白表達(dá)Figure 3 Western blot analysis of P21，P27，and phosphorylated Rb protein expression levels in SIRT1 siRNA-transfected PC3 cells

3 討論

SIRT1屬于sirtuin家族，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的組蛋白去乙?；?，是III類去乙酰化酶中的重要一員［6］。通過去乙?；姸嘟M蛋白和非組蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞的能量代謝、凋亡、能量攝入限制、DNA修復(fù)，影響細(xì)胞存活、衰老和神經(jīng)退行性病變等多種病理生理過程［7-8］。SIRT1具有眾多生物學(xué)作用，其究竟是發(fā)揮促癌作用還是抑癌作用及能否作為未來腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)都引起很多關(guān)注［9］。SIRT1在不同腫瘤組織中的來源和類型不同，其所發(fā)揮的作用也不同。SIRT1通過抑制P53、Bax-Ku70和FOXO轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮促癌作用［10］，SIRT1通過NF-κB/Cyclin D1信號通路抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展［11］。既往有關(guān)SIRT1與前列腺癌關(guān)系的報(bào)道不一致［12-13］，為探索SIRT1在前列腺癌發(fā)生中的作用，本研究使用RNA干擾下調(diào)SIRT1表達(dá)，觀察SIRT1對前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

本研究首先應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染針對人SIRT1序列特異的siRNA，用RT-PCR和Western blot方法驗(yàn)證了SIRT1 siRNA顯著降低內(nèi)源性SIRT1mRNA水平和蛋白表達(dá)，說明siRNA作用的特異性。MTT測定結(jié)果表明干擾SIRT1表達(dá)后，PC3細(xì)胞出現(xiàn)明顯的生長抑制狀態(tài)。細(xì)胞周期是反映細(xì)胞增殖速度的一個重要指標(biāo)，為了研究內(nèi)源性SIRT1對細(xì)胞周期的影響，本研究使用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞48 h后采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。結(jié)果表明，與對照組比較，SIRT1 siRNA處理后G1期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞周期阻滯在G1期。P21、P27和P16等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI）可特異性抑制細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）與CDK形成的復(fù)合物的活性，使磷酸化狀態(tài)的Rb蛋白脫磷酸，并且結(jié)合E2F1阻止細(xì)胞通過G1/S調(diào)控點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯［14-15］。為了探討SIRT1可能阻滯G1期的分子機(jī)制，本研究檢測了細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子P21、P27的蛋白表達(dá)和Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)。PC3細(xì)胞中SIRT1被干擾后細(xì)胞周期抑制性蛋白P21和P27表達(dá)增加，而磷酸化的Rb蛋白表達(dá)降低。以上結(jié)果表明下調(diào)SIRT1表達(dá)后，通過上調(diào)PC3細(xì)胞中P21和P27蛋白表達(dá)，使磷酸化的Rb蛋白脫磷酸進(jìn)而阻滯細(xì)胞于G1期。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明特異性干擾SIRT1表達(dá)能夠抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖和阻滯PC3細(xì)胞周期，其機(jī)制可能與上調(diào)PC3細(xì)胞中P21和P27蛋白表達(dá)，并抑制Rb蛋白的磷酸化相關(guān)。本研究結(jié)果提示，SIRT1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有望成為前列腺癌潛在治療的分子靶點(diǎn)。

1 Chen J,Li HM,Zhang XN,et al.Dioscin-induced apoptosis of human LNCaP prostate carcinoma cells through activation of caspase-3 and modulation of Bcl-2 protein family[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2014,34(1):125-130.

2 Khan MI,Adhami VM,Lall RK,et al.YB-1 expression promotes epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer that is inhibited by a small molecule fisetin[J].Oncotarget,2014,5(9):2462-2474.

3 Li JP,Cao NX,Jiang RT,et al.Knockdown of GCF2/LRRFIP1 by RNAi causes cell growth inhibition and increased apoptosis in human hepatoma HepG2 cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(6):2753-2758.

4 Civenni G,Malek A,Albino D,et al.RNAi-mediated silencing of Myc transcription inhibits stem-like cell maintenance and tumorigenicity in prostate cancer[J].Cancer Res,2013,73(22):6816-6827.

5 Abdelmohsen K,Pullmann R Jr,Lal A,et al.Phosphorylation of HuR by Chk2 regulates SIRT1 expression[J].Mol Cell,2007,25(4):543-557.

6 Byles V,Zhu L,Lovaas JD,et al.SIRT1 induces EMT by cooperating with EMT transcription factors and enhances prostate cancer cell migration and metastasis[J].Oncogene,2012,31(43):4619-4629.

7 Yuan H,Su L,Chen WY.The emerging and diverse roles of sirtuins in cancer:a clinical perspective[J].Onco Targets Ther,2013,6:1399-1416.

8 Li Y,Wong K,Giles A,et al.Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21[J].Gastroenterology,2014,146(2):539-549.

9 Wang RH,Sengupta K,Li C,et al.Impaired DNA damage response,genome instability,and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice[J].Cancer Cell,2008,14(4):312-323.

10 Hori YS,Kuno A,Hosoda R,et al.Regulation of FOXOs and p53 by SIRT1 modulators under oxidative stress[J].PLoS One,2013,8(9):e73875.

11 Yang Q,Wang B,Gao W,et al.SIRT1 is downregulated in gastric cancer and leads to G1-phase arrest via NF-κB/Cyclin D1 signaling[J].Mol Cancer Res,2013,11(12):1497-1507.

12 Kojima K,Ohhashi R,Fujita Y,et al.A role for SIRT1 in cell growth and chemoresistance in prostate cancer PC3 and DU145 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,373(3):423-428.

13 Baptista T,Gra?a I,Sousa EJ,et al.Regulation of histone H2A.Z expression is mediated by sirtuin 1 in prostate cancer[J].Oncotarget,2013,4(10):1673-1685.

14 Zhang XM,Liu C,Zhao S,et al.Mechanism of 9-cisRA in inhibiting the proliferation of thyroid squamous cell carcinoma cell SW579[J].Chin J Clin Oncol,2012,39(11):761-764.[張秀梅,劉 超,趙頌,等.9-順式維甲酸抑制甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW579增殖的作用機(jī)制[J].中國腫瘤臨床,2012,39(11):761-764.]

15 Burke JR,Liban TJ,Restrepo T,et al.Multiple mechanisms for E2F binding inhibition by phosphorylation of the retinoblastoma protein C-terminal domain[J].J Mol Biol,2014,426(1):245-255.