張騰業(yè)，王珍珍，陳仁金，袁紅花，胡安康，吳連連，朱裕華，冀德君，朱孝榮＊

（1.徐州醫(yī)學(xué)院 神 經(jīng)生物研究中心，江蘇 徐 州221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 實 驗動物中心，江蘇 徐 州221004；3.揚(yáng)州大學(xué) 動 科學(xué)院，江蘇 揚(yáng) 州221005）

血紅素氧合酶（HO）是血紅素降解的限速酶，能將血紅素轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)信號分子CO和抗氧化劑膽紅素和鐵［1］，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，主要分布于神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。血紅素氧合酶-2（HO-2）是一種結(jié)構(gòu)型血紅素氧合酶，是生理狀態(tài)下HO的主要存在形式，主要起催化作用。隨著對HO-2逐漸深入研究，其生物特性和作用機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)。

研究表明HO-2上調(diào)HO-1的表達(dá)，并對HO-1功能發(fā)揮起重要作用［2-3］。在體外試驗中，小鼠大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中HO-2基因的缺失能夠誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡［4］，此外HO-2也是急性炎癥反應(yīng)修復(fù)中的一種關(guān)鍵酶，對抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有拮抗作用。而TLR4是Toll樣受體家族的成員的一種，當(dāng)TLR4受到刺激后能引起下游的MyD88、NF-k B等的改變，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［5］，TLR4缺失時能減少炎癥遞質(zhì)的釋放及細(xì)胞凋亡［6］。由此我們推測HO-2可能通過調(diào)節(jié)TLR4通路調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。因此構(gòu)建了它的真核表達(dá)載體，為后續(xù)的試驗工作做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

C57BL／6小鼠由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。真核表達(dá)載體p EF1α-IRES-AcGFP、小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞由徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究中心保存，限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bam H I、Taq酶、T4 DNA 連 接 酶、SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TRIzol試劑，均購自Ta KaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，Promega公司生產(chǎn)；凝膠回收試劑盒、Dnase I，Invitrogen公司生產(chǎn)；HO-2多克隆抗體（Abcam公司）、β-actin單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology），羊抗鼠和羊抗兔的熒光二抗（Santa Cruz Biotechnology）；Odyssey掃描儀（Gene），LightCycler 480 System實時PCR儀 （Roche）；Amaxa 2型-Nucleofector儀（Lonza）。

1.2 p EF1α-HO-2-AcGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取C57BL／6小鼠海馬組織總RNA，用TaKa-Ra反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，以F：5＇-GTGAATTCATGTCTTCAGAGGTGGAGACC（EcoR I）-3＇，R：5＇-TAGGATCCCATGTAGTACCAGGCCAATAG （Bam H I）-3＇為上下游引物擴(kuò)增HO-2基因，擴(kuò)增條件：94℃4 min，94℃40 s，60℃40 s，72℃40 s，72℃10 min，30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物大小，然后將HO-2的PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接載體p EF1α-IRESAcGFP同時用EcoR I和Bam H I雙酶切，酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并回收兩者的酶切產(chǎn)物，將產(chǎn)物按照3：1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶37℃連接24 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行陽性克隆的篩選，提取陽性菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 重組載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染

從液氮中取出凍存的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，37℃水浴復(fù)蘇，傳于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基（10%FBS的DMEM培養(yǎng)基）。對數(shù)生長期的細(xì)胞傳代培養(yǎng)；細(xì)胞單層融合度達(dá)70%～80%時，用電穿孔轉(zhuǎn)染法將重組載體p EF1α-HO-2-AcGFP和空載體pEF1α-IRES-AcGFP轉(zhuǎn)入細(xì)胞。電轉(zhuǎn)染條件：一個電轉(zhuǎn)杯中載體4μg，總體積200μL，T005模式下電擊一次。電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8～12 min，以使核酸充分進(jìn)入細(xì)胞，然后將電轉(zhuǎn)杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出，接種細(xì)胞懸液于預(yù)熱的培養(yǎng)基中，上下吹打均勻后，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。正常培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后，給細(xì)胞換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.4 q-PCR檢測HO-2基因在m RNA水平的表達(dá)

電轉(zhuǎn)染48 h后，收集重組載體和空載體轉(zhuǎn)染的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，嚴(yán)格按照TRIzol Reagent說明書進(jìn)行RNA抽提。取1μg的RNA按照TaKa-Ra公司Prime Script?RT Master Mix Perfect Peal Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA。然后以cDNA為模板，用羅氏LightCycler?480 System實時定量PCR。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，F(xiàn)：TACTTCACATACTCAGCCCT，R：ATGGGCCACCAGCAGCTCTG。定量PCR的體系為：2×SYBR?Premix Ex Taq TM（Tli RNase H Plus）10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA模板1μL，d H2O配成20μL總體系。反應(yīng)條件：95℃30 sec，95℃5 sec，60℃20 sec，65℃15 sec，40次循環(huán)。以2-△△ct法度量HO-2基因的m RNA的相對表達(dá)量，以β-actin基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)。

1.5 Western blot檢測HO-2基因在蛋白水平的表達(dá)

取重組載體和空載體轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞提取蛋白，取80μg蛋白上樣量，80 V電壓下10%SDSPAGE凝膠電泳，等條帶到達(dá)濃縮膠與分離膠接觸面時換成100 V電泳100 min，然后用半干電轉(zhuǎn)儀40 m A恒流轉(zhuǎn)45 min將膠上蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜完成后用5%的脫脂奶粉封閉2 h。然后與1∶1000稀釋的HO-2一抗（兔的多克隆抗體）和1∶1000稀釋的β-actin一抗（鼠的單克隆抗體）4℃ 孵育過夜，次日用Wash Buffer洗滌3次，每次5 min，用抗兔和抗鼠的熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育2 h后，洗滌3次（避光）用odyssey掃描NC膜。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p EF1α-HO-23AcGFP真核表達(dá)載體的鑒定

HO-2 cDNA PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增的目的條帶為均一條帶，條帶848 bp大?。ㄒ妶D1）。經(jīng)EcoR I酶、Bam H I酶對重組載體進(jìn)行雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，顯示得到兩個條帶，大小符合預(yù)期結(jié)果（見圖2），表明重組載體構(gòu)建成功。

2.2 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后HO-2在mRNA水平表達(dá)

重組載體和空載體轉(zhuǎn)染48 h后，實時定量結(jié)果顯示（圖3）：重組載體轉(zhuǎn)染的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)HO-2基因m RNA水平極顯著高于對照組（P＜0.01），說明重組載體在小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠過表達(dá)。

2.3 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后HO-2在蛋白水平表達(dá)

重組載體和空載體轉(zhuǎn)染小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，48 h后提取總蛋白，Western blot方法檢測結(jié)果（圖4）顯示：重組載體（HO-2 overexp）和空載體（Control）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白在36 k D處有特異性條帶，重組載體組較空載體組條帶明顯（A）。統(tǒng)計學(xué)分析：重組載體轉(zhuǎn)染的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞HO-2基因蛋白水平顯著高于對照組，P＜0.05（B）。

圖1 HO-2 cDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M.marker 3；1.HO-2 cDNAFig.1 The result of agarose gel electfophoresisof HO-2 cDNA（M.marker 3；1.HO-2

圖2 重組載體EcoR I／Bam H I雙酶切瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M.marker3，1.重組載體的雙酶切片段Fig.2 The result of agarose gel electfophoresis of recombinant vector by EcoR I／Bam H I double enzyme digestionM.marker3，1.double enzyme segment of recombinant vector

3 討 論

圖3 實時定量PCR檢測重組載體轉(zhuǎn)染后HO-2基因m RNA的表達(dá)水平與空載體相比，＃P＜0.01Fig.3 Statistical graph of detection of HO-2 gene mRNA expression after recombinant vector transfection by Real-time PCR＃P＜0.01 vs empty vector

HO-2主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮中，在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，分子量約為36 k D，它能對抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，參與急性炎癥反應(yīng)修復(fù)，減少炎癥損傷。HO-2抗凋亡抗炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，目前多認(rèn)為與它降解血紅素產(chǎn)生的CO神經(jīng)信使的作用有關(guān)［7］。有研究表明HO-2在TNF-α引起的大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中有保護(hù)作用，HO-2表達(dá)量增加能明顯減弱TNF-α引起的損傷［8-9］。然而HO-2與TNF-α之間的作用機(jī)制尚不清楚。TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可分為My D88依賴和MyD88非依賴途徑［10］。當(dāng)TLR4受到脂多糖等效應(yīng)物刺激后能通過My D88依賴的信號通路上調(diào)TNF-a的表達(dá)量。HO-2基因敲除鼠與野生型鼠比較發(fā)現(xiàn)，HO-2基因敲除鼠中炎癥分子水平的明顯升高，其中包括 TNF-α［11-12］。據(jù)此可推測HO-2可能通過TLR4的My D88依賴的信號通路抑制TNF-a的表達(dá)。為此，我們構(gòu)建了它的真核表達(dá)載體，檢測HO-2基因過表達(dá)后能否通過MyD88依賴的TLR4信號通路減少抑制TNF-a的表達(dá)。

圖4 Western blot檢測重組載體轉(zhuǎn)染后HO-2在蛋白水平表達(dá)情況A.Western blot圖，B.統(tǒng)計學(xué)分析圖。與control相比，＊P＜0.05。Fig.4 Detection of HO-2 expression in protein levels after recombinant vector transfection by Western blotA.Picture of Western blot，B.Statistical graph.＊P＜0.05 vs control.

本試驗重組得到HO-2的真核表達(dá)載體p EF1α-HO-2-AcGFP，雙酶切鑒定和測序表明載體構(gòu)建成功。定量PCR和Western blot顯示pEF1α-HO-2-AcGFP能在小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞成功過表達(dá)，且達(dá)顯著水平。為下一步研究HO-2基因抗凋亡、抗氧化、減少炎癥損傷機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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