柳泰宇　柳希

【摘 要】生物堿類化合物大多數(shù)具有生理活性，往往是許多中草藥及藥用植物的有效成分。本文以氯仿為溶劑，索氏法提取木蓮枝和葉中的生物堿。溴甲酚綠為顯色劑，在pH=5.4條件下，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量。本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好，研究結(jié)果為木蓮的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】木蓮；生物堿；含量測(cè)定

一、前言

生物堿類化合物大多數(shù)具有生理活性，往往是許多中草藥及藥用植物的有效成分。生物堿作為有效成分之一，其含量的高低直接與藥材的質(zhì)量和療效有關(guān)。制定科學(xué)合理的提取工藝，保證有效成分生物堿的提取效率，從而有效地控制中藥材質(zhì)量，保證藥效是非常重要的。[1]

木蓮（Manglietia hainanensis Dandy）為木蘭科木蓮屬植物，在我們海南，木蓮被稱為龍楠樹(shù)、綠楠、綠蘭等，主要分布于海南定安、保亭、樂(lè)東、瓊中、陵水、三亞、東方等市縣，生于海拔300——1200m的溪邊、密林中，是海南特產(chǎn)植物[2，3]，屬國(guó)家三級(jí)植物保護(hù)種；文獻(xiàn)[4]曾報(bào)道過(guò)對(duì)海南木蓮的TLC鑒定研究。木蓮屬植物民間藥用較多，為進(jìn)一步拓展本屬藥用植物種類，我們對(duì)海南木蓮枝和葉中的生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定。

從目前的研究來(lái)看，對(duì)木蓮中的生物堿含量測(cè)定未曾見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)于測(cè)定生物堿的含量來(lái)說(shuō)，測(cè)定方法有紫外分光光度法，兩相滴定法[5]、非水滴定法[6]、HPLC-UV[7]、HPLC-ELSD[8]，GC[9]等。中藥材中生物堿提取方法常用的有冷浸取、回流提取、索氏提取和超聲波震蕩提取等。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光法，測(cè)定方法較為普遍，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確靈敏的，而生物堿的提取，一般采用索氏提取，因?yàn)橛盟魇咸崛⌒Ч容^好，而且溶液澄清，不需要進(jìn)行抽濾。

首先進(jìn)行的是氯仿通過(guò)索氏提取將木蓮中的生物堿進(jìn)行提取，配制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，顯色劑和緩沖溶液，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對(duì)海南木蓮中的生物堿進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定。為了對(duì)該方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行研究，還進(jìn)行了加標(biāo)回收率和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)這一部分的實(shí)驗(yàn)，可以確定，使用紫外分光光度法測(cè)定海南木蓮中的生物堿，是準(zhǔn)確可靠的。

二、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器、材料與試劑

（1）儀器

PHS-3C型酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析儀器廠）； UV757型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；FA1604電子天平（上海精科天平）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；D2F-200 型真空干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；微型植物粉碎機(jī)和索氏提取器自制。

（2）材料

海南木蓮枝和葉于2009年2月采集于海南省樂(lè)東縣尖峰嶺，自然晾干，粉碎備用。

（3）試劑

鹽酸小檗堿（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度99.99%），溴甲酚綠（上海試劑三廠），鄰苯二甲酸氫鉀（廣州化學(xué)試劑廠），檸檬酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠），檸檬酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠），氯仿（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），濃氨水（廣州市番禺力強(qiáng)化工廠），氫氧化鈉（天津市百世化工有限公司）等，所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用水為蒸餾水。

（二）試驗(yàn)方法

（1）緩沖溶液及顯色劑的配制

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱量10.507g 檸檬酸，用蒸餾水溶解于500mL的容量瓶中并定容至刻度，得濃度為0.1mol/L的溶液。準(zhǔn)確稱量14.705g檸檬酸鈉，用蒸餾水溶解于500mL的容量瓶中并定溶至刻度，得濃度為0.1mol/L的溶液，備用。分別取16 mL 0.1mol/L的檸檬酸溶液和34mL 0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液放置于100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，得pH為5.4的緩沖溶液。

參照文獻(xiàn)[10]配制溴甲酚綠指示液：精密稱取溴甲酚綠0.125g，用0. 1 mol/L的 NaOH 25. 00 mL溶解后，加入鄰苯二甲酸氫鉀2.55 g，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，搖勻備用。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

在電子天平上精密稱取鹽酸小檗堿10.0mg放入小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取濃度為200μg/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mL于分液漏斗中，分別標(biāo)上序號(hào)1，2，3，4，5，6。各加水至1.0 mL，用吸量管加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液5.0mL，再依次精密加入溴甲酚綠指示液2.0 mL，氯仿10.0 mL，充分振搖1 min，放置分層，靜置1h，取氯仿層備用。

另精密量取10.0 mL氯仿，以同樣的方法操作制備空白對(duì)照液。在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定氯仿液。以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）木蓮枝和葉生物堿的提取

稱取干燥至恒重的木蓮葉和枝粉末各10.0g，加濃氨水約3 mL浸濕，拌勻，加氯仿200mL，用索氏提取器提取5h。

將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收部分氯仿后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度，得海南木蓮葉和枝的生物堿氯仿提取液。

（5）樣品中生物堿含量的測(cè)定

分別準(zhǔn)確量取1.0 mL和0.4mL的枝和葉的提取液置于分液漏斗中，按2.2.3項(xiàng)下的方法操作測(cè)其吸光度。根據(jù)下述公式進(jìn)行計(jì)算，得木蓮葉和枝中的生物堿含量。

（1—1）

（6）精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取0.4mL葉和1.0mL枝于分液漏斗中，按照2.2.3項(xiàng)下的配制方法，平行測(cè)定5次，考察測(cè)定方法的精密度。

（7）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備溶液，在1-90min時(shí)間內(nèi)測(cè)定其吸光度變化值，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的穩(wěn)定性。

（8）加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密量取已知生物堿含量的海南木蓮葉5份，每份0.3 mL，分別準(zhǔn)確加入200.0 μg/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 mL，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備樣品供試液和空白對(duì)照液，在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定。

同法，精密量取海南木蓮枝0.5 mL，200.0μg/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)下述公式進(jìn)行計(jì)算，得木蓮葉和枝的加標(biāo)回收率。

（1—2）

三、結(jié)果與討論

（一）最大吸收波長(zhǎng)的選擇

以氯仿為對(duì)照，將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和空白對(duì)照液在350-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示在410nm有最大吸收值，而空白對(duì)照液在410 nm幾乎沒(méi)有吸收，故本實(shí)驗(yàn)選擇410 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。波長(zhǎng)掃描曲線見(jiàn)圖1。

（二）工作曲線與回歸方程

按2.2.5項(xiàng)下的方法測(cè)定，測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸小檗堿溶液在2.0-18.0μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。得回歸方程為：A = 0.03841c - 0.01015； 相關(guān)系數(shù)r = 0.999 9 （n = 6）。

（三）木蓮中生物堿含量的測(cè)定結(jié)果

按照2.2.5項(xiàng)下的測(cè)定方法，得木蓮不同部位中的生物堿含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 海南木蓮葉中生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表3 木蓮枝中生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)

從測(cè)定結(jié)果可知，木蓮葉中的生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.450%，RSD=0.838%（n=5），枝中的生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0896%，RSD=0.41%（n=5）。結(jié)果表明，葉中生物堿的含量更高。

（四）木蓮中生物堿含量的測(cè)定結(jié)果

（1）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按2.2.5項(xiàng)下方法，測(cè)定1-90min之間的吸光度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性曲線測(cè)定數(shù)據(jù)

（2）加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

從測(cè)定結(jié)果可知，木蓮葉的平均回收率為96.4 %，RSD = 1.4 %（n=5）. 木蓮枝的平均回收率為99.6 %，RSD = 0.86 %（n=5）.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，表6.

表5 葉的平均回收率

表6 枝的平均回收率

（五）討論

木蓮中的生物堿的提取運(yùn)用索氏提取，因?yàn)橛盟魇咸崛⌒Ч容^好，而且溶液澄清，不需要進(jìn)行抽濾。以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，溴甲酚綠為顯色劑，在pH=5. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液條件下，與溴甲酚綠顯色，得到海南木蓮不同部位中的生物堿的相對(duì)含量。采用紫外分光光法，對(duì)木蓮中的生物堿進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法，是因?yàn)樵摲`敏度高，準(zhǔn)確性好，操作簡(jiǎn)便，克服了重量法和滴定法均需多次萃取，易造成誤差而導(dǎo)致重現(xiàn)性差的不足。同時(shí)，該法適于較少量樣品的檢測(cè)。

為了對(duì)該方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行研究，還進(jìn)行了加標(biāo)回收率和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)這一部分的實(shí)驗(yàn)，可以確定，使用紫外分光光度法測(cè)定海南木蓮中的生物堿，是準(zhǔn)確可靠的。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用紫外-分光光度法，測(cè)定木蓮中的生物堿含量的方法，建立一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確靈敏的生物堿定量分析方法。通過(guò)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)木蓮葉中的生物堿含量比枝中的要高，本研究結(jié)果為木蓮的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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