洪德芳，艾冬冬，丁麟超，呂建新，鐘連進(jìn)，厲保秋，高麗昌，金麗琴

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.山東弘立醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

白細(xì)胞介素（IL）-18是一種炎癥和免疫增強(qiáng)因子，刺激Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌干擾素γ（IFN-γ），明顯增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng)，具有良好的抑制腫瘤作用[1-2]。然而由于IL-18的效應(yīng)細(xì)胞廣泛分布于人體全身，易引起全身的炎癥反應(yīng)。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在許多惡性腫瘤細(xì)胞表面均過度表達(dá)，對一些惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖及侵襲等方面起關(guān)鍵作用[3-5]。有研究表明，EGFR配體的第三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)保守基序（C-loop）可特異性與腫瘤細(xì)胞表面的EGFR結(jié)合但并無活化EGFR的功能[6]。因此，彭穎等[7-9]通過融合EGF受體干擾基序和IL-18成熟肽分子，構(gòu)建了一種能靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞的rhEGF-IL-18融合蛋白，并將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。

為了進(jìn)行rhEGF-IL-18融合蛋白在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，為后續(xù)的臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)，需要建立一種可靠的血藥濃度檢測方法。為此，本研究選擇了比較具有代表性的食蟹猴進(jìn)行給藥，針對蛋白類藥物的特點(diǎn)建立了檢測給藥食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白濃度的直接競爭ELISA方法，并對其進(jìn)行了方法學(xué)評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及抗體：rhEGF-IL-18標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL）由溫州醫(yī)科大學(xué)提供；抗rhEGF-IL-18抗體血清由山東弘立醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究有限公司提供；抗rhEGF-IL-18抗體和酶標(biāo)抗原委托北京博奧森生物技術(shù)有限公司純化制備。

1.1.2 主要儀器及試劑：多功能酶標(biāo)儀（OLYMPUS）；96孔可拆酶標(biāo)板（CORNING）；高速低溫離心機(jī)（BeckMan）；食蟹猴空白血清（山東弘立醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA操作流程：①包被：將稀釋到工作濃度的抗rhEGF-IL-18抗體加入到ELISA板條中，每孔100μL，4 ℃中包被過夜。②封閉：每孔加入200μL的封閉液（0.01 mol PBS 15倍稀釋1.5%干酪素），37 ℃ 2 h后甩干，放4 ℃?zhèn)溆谩＂奂訕樱簩hEGF-IL-18稀釋到規(guī)定濃度后加入包被板條中（100μL/孔），樣品稀釋液（0.01 mol PBS 30倍稀釋1.5%干酪素）中含有50%的食蟹猴空白血清；關(guān)于待測的rhEGF-IL-18樣品：每孔加50μL的樣品稀釋液，再加50μL的待測樣品。將酶標(biāo)板在37 ℃恒溫箱中放置60 min后，用洗液（含0.05%吐溫的0.01 mol PBS）洗板5次并拍干。④加酶標(biāo)抗原：將稀釋到工作濃度的酶標(biāo)抗原（100μL/孔）加在ELISA板孔底部，37 ℃孵育30 min后洗板5次并拍干。⑤顯色：在酶標(biāo)板每孔中加入100μL TMB顯色液，37 ℃中避光顯色10 min。⑥終止：每孔加入50μL反應(yīng)終止液（2 mol/L硫酸），終止反應(yīng)。⑦檢測：以450 nm波長檢測各孔OD值。

1.2.2 包被抗體和酶標(biāo)抗原工作濃度的確立：用棋盤法確定包被的抗rhEGF-IL-18抗體和酶標(biāo)抗原最佳工作濃度，分別將包被的抗體稀釋為一系列濃度：0.5、1、2、3、4、5、6、10μg/mL；酶標(biāo)抗原做1:500、1:1 000、1:2 000、1:3 000、1:4 000和1:5 000稀釋，進(jìn)行ELISA法測定。同一酶標(biāo)抗原濃度下，OD450值隨包被抗體倍比而成倍比時的濃度為酶標(biāo)抗原理想工作濃度，最后選擇OD450值在1.5～2.0時的包被抗體濃度為其理想工作濃度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在上述確定的最佳反應(yīng)條件下，用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGFIL-18標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800和900 ng/mL進(jìn)行ELISA法測定，每個濃度5個樣本。以未加rhEGF-IL-18標(biāo)準(zhǔn)品的孔為陰性孔，測定各孔的OD450。以O(shè)D450值為橫坐標(biāo)，rhEGF-IL-18標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 方法學(xué)評價(jià)：①穩(wěn)定性：用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGF-IL-18標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度分別為200、400、800 ng/mL的溶液，每個濃度5個樣本，分別于室溫下放置1 h，ELISA方法測定樣品濃度，評價(jià)短期室溫放置條件下樣品的穩(wěn)定性；于冰箱-20 ℃貯存24 h取出室溫解凍，按ELISA方法測定樣品濃度，重復(fù)一次；于冰箱-20 ℃貯存，于第0、第6、第20天取出室溫解凍，ELISA方法測定樣品濃度，評價(jià)凍存穩(wěn)定性。②精密度和準(zhǔn)確性：用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGF-IL-18標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度分別為200、400、800 ng/mL的溶液，按照ELISA方法測定樣品濃度，每個濃度5個樣本，連續(xù)配制、測定3 d，根據(jù)樣品結(jié)果計(jì)算準(zhǔn)確度與精密度。③回收率：食蟹猴空白血清90 L，分別加入2、4和8μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的濃度為200、400、800 ng/mL，混勻后，ELISA方法測定每個濃度5個樣本?；厥章?樣品濃度/配制濃度×100%。④定量下限：食蟹猴空白血清90 L，加入0.2μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的濃度為20 ng/mL，混勻后，ELISA方法測定6個樣本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Excel軟件計(jì)算血清藥物濃度個體值、均值（ ±s）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD或S）、相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）和相對偏差（RE）。

2 結(jié)果

2.1 包被抗體和酶標(biāo)抗原工作濃度的選擇 在不同包被抗體濃度下，以酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為橫軸、OD450為縱軸繪制反應(yīng)曲線（見圖1）。從圖中可以看出，當(dāng)包被抗體濃度為4μg/mL、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為1 000倍時，OD450值隨包被抗體倍比而成倍比，且在1.5～2.0左右。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在上述最佳反應(yīng)條件下，制備ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），并作相關(guān)回歸分析，其回歸方程為y=486.74x2-1693.7x+1478.5，R2=0.9898，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為100～900 ng/mL，反映了本檢測法的可靠性。

圖1 包被抗體和酶標(biāo)抗原不同工作濃度下的ELISA法檢測

2.3 穩(wěn)定性評價(jià) 每個濃度設(shè)置5個重復(fù)樣本進(jìn)行凍融，結(jié)果表明rhEGF-IL-18血清樣品室溫放1 h、凍融2次和凍存20 d均較穩(wěn)定，RSD均明顯小于15%（見表1-3）。

表1 rhEGF-IL-18樣品室溫放置1 h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表2 rhEGF-IL-18樣品反復(fù)凍融2次穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表3 rhEGF-IL-18樣品凍存20 d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4 精密度與準(zhǔn)確性評價(jià) 每個濃度設(shè)置5個重復(fù)樣本，連續(xù)測定3 d。結(jié)果顯示日內(nèi)精密度及日間精密度變異系數(shù)（RSD）均在2.5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度（RE）均小于3%（見表4）。

表4 ELISA法測定rhEGF-IL-18準(zhǔn)確度與精密度

2.5 回收率評價(jià) 每個濃度設(shè)置5個重復(fù)樣本，回收率=樣品濃度/配制濃度×100%。本法測定rhEGFIL-18在食蟹猴血清中濃度藥物為200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL的回收率為95.3%～103.0%（見表5），符合回收率80%～120%的標(biāo)準(zhǔn)。

表5 rhEGF-IL-18在食蟹猴血清中的提取回收率

2.6 定量下限研究 設(shè)置6個重復(fù)樣本進(jìn)行研究。本方法的定量下限為20 ng/mL，變異系數(shù)（RSD）在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度（RE）小于3%（見表6）。

表6 ELISA法測定EGF-IL-18最低定量下限

3 討論

隨著人們對腫瘤基因及其發(fā)展機(jī)制的不斷深入研究，針對腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中關(guān)鍵分子的特異性治療已逐步取代傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物篩選成為腫瘤藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)[10]。由于低毒性和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，分子靶向治療在腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用[11]。rhEGF-IL-18融合蛋白是一種新型的腫瘤靶向細(xì)胞因子，可使效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性近距離接觸。融合蛋白能與效應(yīng)細(xì)胞表面的IL-18受體和腫瘤細(xì)胞表面的EGFR結(jié)合，從而起到共價(jià)橋聯(lián)作用，能更有效地發(fā)揮免疫激活作用。rhEGFIL-18融合蛋白不僅能誘導(dǎo)殺傷局部腫瘤細(xì)胞，還能通過免疫網(wǎng)絡(luò)激活和放大抗腫瘤免疫作用[12]。

目前測定生物體內(nèi)蛋白多肽藥物的方法主要有免疫分析法、同位素標(biāo)記示蹤法和生物測定法。相較于其他兩種方法而言，免疫分析法具有經(jīng)濟(jì)、快速和靈敏等優(yōu)點(diǎn)。ELISA法是免疫分析法中使用最頻繁的，具有操作簡單，不需要無菌操作，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于醫(yī)學(xué)及食品檢驗(yàn)中。在本研究中，通過rhEGF-IL-18融合蛋白和酶標(biāo)抗原競爭抗rhEGF-IL-18抗體形成固相復(fù)合物，通過顯色后測定OD450得到一條較穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.9898）。經(jīng)過方法學(xué)評價(jià)，日內(nèi)精密度和日間精密度變異系數(shù)均小于2.5%；回收率95.3%～103.0%；樣品在室溫放置1 h、凍融2次和凍存20 d三種條件下檢測結(jié)果均較穩(wěn)定；定量下限為20 ng/mL。這些均符合相關(guān)指標(biāo)的要求，表明我們建立的直接競爭ELISA方法重復(fù)性好，系統(tǒng)穩(wěn)定，可用于食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白的測定，為rhEGF-IL-18融合蛋白的藥代動力學(xué)及后續(xù)的研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

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