馮育芳, 邢 進(jìn), 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所, 北京 100050)

PCR技術(shù)在小鼠CAR桿菌檢測(cè)中的初步應(yīng)用

馮育芳, 邢 進(jìn), 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所, 北京 100050)

目的 建立有效的CAR桿菌(Cilia-associated respiratory bacillus)PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行初步應(yīng)用。方法 針對(duì)NCBI公布的CAR桿菌序列，選取大小合適的序列，合成質(zhì)粒，并設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增出的陽性片段進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證該方法的可靠性。結(jié)果 成功建立了CAR桿菌的PCR檢測(cè)方法，初步應(yīng)用驗(yàn)證了該方法的可靠性。結(jié)論 該方法的建立為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

CAR 桿菌; PCR; 應(yīng)用

CAR桿菌(Cilia-associated respiratory bacillus)是由Van Zwieten于1980年分離于肺炎大鼠的肺組織,該菌可引起多種動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。嚙齒類CAR桿菌病以體質(zhì)量減輕, 被毛凌亂, 咬牙或噴氣聲為特征[2], 幾乎所有患病動(dòng)物都出現(xiàn)黏液性支氣管炎和慢性支氣管擴(kuò)張。目前美國(guó)、日本、意大利、澳大利亞等國(guó)家均發(fā)現(xiàn)并分離到該細(xì)菌, 并將其列為檢測(cè)項(xiàng)目。雖然我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒有要求檢測(cè)該菌，鑒于該細(xì)菌的危害和廣泛分布，作者認(rèn)為我國(guó)也有必要建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。

CAR桿菌生長(zhǎng)條件要求高, 這種生長(zhǎng)特性給CAR桿菌的檢測(cè)帶來一定困難[3]; 目前常用的血清學(xué)[4]、免疫組織化學(xué)[5]和組織病理學(xué)方法均存在特異性差和靈敏度低等問題。本研究擬建立CAR桿菌PCR檢測(cè)方法, 為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒合成

根據(jù)GenBank上CAR桿菌的兩個(gè)16SRNA序列U09452.1和L11886.1進(jìn)行比對(duì)分析, 篩選相對(duì)保守和特異性的序列(450 bp), 由Takara公司合成該特異性序列, 并連接到質(zhì)粒, 作為后續(xù)試驗(yàn)的陽性對(duì)照。

1.2 引物設(shè)計(jì)

通過primer 5軟件對(duì)該段保守序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表1)，委托Takara公司合成。

表 1 引物名稱、序列及擴(kuò)增片段

1.3 樣本采集及DNA提取

無菌分離大、小鼠氣管于氣管浸液中，充分震蕩，吸取200 μl液體，用Qiagen的Dneasy Blood& Tissue Kit (Cat. No.69504)提取氣管浸液中的DNA，詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

PCR 反應(yīng)體系為 50 μl, 包括: 10 × buffer 5 μl,dNTP 4 μl, DEPC 水 29.75 μl，引物各 2.5 μl，Hs Taq 酶 2.5 μl，DNA 5 μl。通過實(shí)驗(yàn)對(duì) PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，并送Takara公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 特異性測(cè)定

將該理論擴(kuò)增序列以及雙向引物與GeneBank上的序列進(jìn)行blast比對(duì)，確定是否為特異性片段。另取本室保存的菌種(肺支原體、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌、多殺巴斯德桿菌、支氣管鮑特桿菌、泰澤菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、念珠狀鏈桿菌)按上述方法提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)不同細(xì)菌種間PCR擴(kuò)增的特異性。

1.6 敏感性測(cè)定

將所合成的質(zhì)粒倍比稀釋為20 μl/ml、2 μl/ml、2.0 × 10-1μl/ml、2.0 × 10-2μl/ml、2.0 × 10-3μl/ml、2.0 × 10-4μl/ml、2.0 × 10-5μl/ml、2.0 × 10-6μl/ml、2.0 × 10-7μl/ml、2.0`× 10-8μl/ml、2.0 ×10-9μl/ml、2.0×10-10μl/ml，用上述PCR方法進(jìn)行測(cè)定，以確定其檢測(cè)閾值。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)體系建立

2.1.1 檢測(cè)條件確定 以合成的質(zhì)粒為陽性對(duì)照模板，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)CAR桿菌檢測(cè)的引物進(jìn)行篩選，最后確定檢測(cè)引物為第3對(duì)引物(即Car5, Car6)，并對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后確定最適反應(yīng)條件為 94℃ 5 min; 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s,重復(fù)35個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min(圖1)。

2.1.2 特異性測(cè)定 圖2為特異性測(cè)定結(jié)果，1～8分別為肺支原體、肺炎支原體、嗜肺巴斯德桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌, 9為陽性對(duì)照(質(zhì)粒)，10為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，只有陽性對(duì)照出現(xiàn)陽性條帶。

2.1.3 敏感性測(cè)定 用上述方法做12個(gè)稀釋度，1～12為10倍系列稀釋結(jié)果，13為陰性對(duì)照。從圖3可見本實(shí)驗(yàn)方法最高可檢測(cè)2.0×10-7μg/ml。

2.2 初步應(yīng)用

將所收集的小鼠、沙鼠的氣管組織樣本, 均按上述方法提取DNA, 并用Car5、Car6引物擴(kuò)增特異性片段, 以檢測(cè)是否存在Car桿菌的感染, 共檢測(cè)沙鼠的氣管樣本65份, 小鼠的氣管樣本60份; 沙鼠氣管中未檢出CAR桿菌(圖4), 小鼠檢出數(shù)例CAR桿菌(圖5), 并送Takara公司進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果(圖6)上ncbi進(jìn)行比對(duì), 結(jié)果證實(shí)為CAR桿菌上特異性序列。

M: Marker, P/C: 陽性對(duì)照, N/C: 陰性對(duì)照?qǐng)D 1 合成質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果M: Marker, P/C: Positive contorl, N/C: Negative contorlFigure 1 The Result of the plasmid

圖 2 特異性試驗(yàn)Figure 2 The specificity test

圖 3 敏感性試驗(yàn)Figure 3 The sensibility test

圖 4 沙鼠樣本CAR桿菌檢測(cè)結(jié)果Figure 4 The Result of samples from gerbil by the PCR assay

圖 5 小鼠樣本CAR桿菌檢測(cè)結(jié)果Figure 5 The Result of samples from mice by the PCR assay

圖 6 CAR桿菌陽性樣本測(cè)序結(jié)果Figure 6 The sequencing Result of CAR positive sample

3 討論

CAR桿菌主要通過直接接觸傳染，目前還沒有證據(jù)證明可以通過污染物、帶菌動(dòng)物或氣溶膠傳染，所以哨兵動(dòng)物并不能有效檢測(cè)該菌。該菌在種群內(nèi)傳染的可能性尚無法排除，因此動(dòng)物群應(yīng)該定期篩查CAR桿菌，引入的動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行檢疫，排除該菌的感染。

在所有的易感動(dòng)物中，CAR桿菌以隱性感染為主。如果出現(xiàn)臨床癥狀，主要是長(zhǎng)期感染和典型的呼吸系統(tǒng)疾病。在呼吸道疾病的相關(guān)研究中，有慢性呼吸道疾病的動(dòng)物一般是不適用的，所以在進(jìn)行該類型實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)該排除CAR桿菌的感染。

CAR桿菌對(duì)培養(yǎng)有特殊要求，需含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基或雞胚，給培養(yǎng)帶來一定難度，而血清學(xué)方法又有較高的假陽性率?；谝陨显?，本實(shí)驗(yàn)選擇PCR方法檢測(cè)該菌，但國(guó)內(nèi)目前沒有分離到CAR桿菌標(biāo)準(zhǔn)株[3]，從而無法設(shè)立陽性對(duì)照。本研究通過對(duì)ncbi上所公布的序列進(jìn)行分析，找出相對(duì)保守的序列合成質(zhì)粒，并將其作為標(biāo)準(zhǔn)參照品，通過對(duì)特異性引物的選擇，體系的優(yōu)化，敏感性、特異性的研究，建立了高靈敏度、高特異性的PCR方法，并對(duì)65份沙鼠及60份小鼠的氣管樣本進(jìn)行篩查，沙鼠中沒有發(fā)現(xiàn)陽性，而SPF小鼠中有陽性，隨機(jī)選取2份SPF小鼠樣本進(jìn)行測(cè)序，Blast比對(duì)結(jié)果為CAR桿菌特異性序列，驗(yàn)證了該方法的可行性。所以，本研究所建立的CAR桿菌PCR檢測(cè)方法可用于日常檢測(cè)工作。

范薇等[6]利用CAR桿菌的特有16SrRNA基因序列片段267 bp設(shè)計(jì)引物，通過從日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲取的CAR標(biāo)準(zhǔn)株DNA, 建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測(cè)方法, 對(duì)國(guó)內(nèi)455份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本進(jìn)行篩查, 未檢出CAR桿菌感染[6]?？赡茉蚴撬鶛z測(cè)樣本沒有該菌感染或所檢測(cè)樣本的CAR桿菌與日本標(biāo)準(zhǔn)CAR桿菌的序列存在差異。本實(shí)驗(yàn)首次在SPF小鼠中檢出CAR桿菌，提示我國(guó)也存在CAR桿菌的感染，應(yīng)該引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技界足夠的重視。

[1] Sasaki Y, Endo R, Koido Y. Direct mutagens in the gaseous component of automobile exhaust detected with Bacillus subtilis spores[J]. Mutat Res, 1980, 79(2):181-184.

[2] Ganaway JR, Spencer TH, Moore TD, et al. Isolation,propagation, and characterization of a newly recognized pathogen, cilia-associated respiratory bacillus of rats, an etiological agent of chronic respiratory disease[J]. Infect Immun,1985, 47(2):472-479.

[3] 李紅. 我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)質(zhì)量檢測(cè)中亟待解決的若干問題[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志, 2002, 12(6):364-367.

[4] Matsushita S, Kashima M, Joshima H. Serodiagnosis of ciliaassociated respiratory bacillus infection by the indirect immunofluorescence assay technique[J]. Lab Anim, 1987, 21(4):356-359.

[5] Orós J, Matsushita S, Rodriguez JL， et al. Demonstration of rat CAR bacillus using a labelled streptavidin biotin(LSAB) method[J]. J Vet Med Sci, 1996, 58(12):1219.

[6] 范薇, 隋麗華, 劉大偉，等. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CAR 桿菌 16SrRNA基因 PCR 監(jiān)測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2010,18(004):308-311.

Application of PCRMethodsfor Detection of Cilia-Associated Respiratory Bacillus in Mouse

FENG Yu-fang, XING Jin, YUE Bing-fei
(Institute for Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo establish an effective PCR assay for detection of cilia-associated respiratory bacillus, and applicate the method for detection in mouse.MethodsSequence of CAR bacillus was obtained from NCBI genbank. A plasmid was structured by selecting the appropriate sequence. And primers were designed based on the sequence; the positive amplified fragments were sequenced to verify the reliability of the method.ResultsThe PCR method for detection of CAR bacillus was successfully established.ConclusionThe establishment of the method will help the detection of experimental animals for CAR bacillus.

Cilia-Associated Respiratory Bacillus; PCR; Application

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0136-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.011

2013-08-19

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究(2013BAK11B01)

馮育芳(1981-), 女, 助理研究員, 碩士, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè), E-mail: fyf307@126.com

岳秉飛(1960-), 男, 博士, 研究員, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué), E-mail: y6784@126.com