張 怡, 詹維偉, 吳永杰, 周吳剛, 陳棟睿, 蔣為民, 鄭 琳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院1. 附屬瑞金醫(yī)院超聲科, 上海 200025;

2. 附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所, 上海 200025; 3. 病理學(xué)教研室, 上海 200025)

血脂對大鼠離體動脈環(huán)張力的影響

張 怡1, 詹維偉1, 吳永杰2, 周吳剛2, 陳棟睿2, 蔣為民3, 鄭 琳3

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院1. 附屬瑞金醫(yī)院超聲科, 上海 200025;

2. 附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所, 上海 200025; 3. 病理學(xué)教研室, 上海 200025)

目的 觀察高脂血癥大鼠及動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈環(huán)張力的變化, 方法 SD大鼠隨機分為4組(T1組，n=10，高膽固醇喂養(yǎng)4周; T2組, n=10，高膽固醇喂養(yǎng)12周; C1組，n=10，正常飲食4周; C2組，n=10，正常飲食12周)，各組動物均測定血清血脂濃度及腹主動脈環(huán)對苯腎上腺素, 高鉀溶液及乙酰膽堿的反應(yīng), 并均行病理切片, 再光鏡檢查以評估主動脈粥樣硬化的程度。結(jié)果 T1組的最大收縮張力值及最大舒張百分比顯著低于C1組(P＜0.01; P=0.001)。T2組的最大收縮張力值顯著高于C2組(P＜0.05)，最大舒張百分比顯著低于C2組(P＜0.001)。T2組的最大收縮張力值顯著高于T1(P＜0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示: 最大收縮張力值與甘油三酯呈顯著正相關(guān)(r=0.435, P＜0.05)。最大舒張百分比與收縮壓、總膽固醇及低密度脂蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318,P=0.046; r=-0.449, P=0.004; r=-0.411, P=0.008), 與高密度脂蛋白呈顯著正相關(guān)(r=0.324,P=0.041)。結(jié)論 高脂飲食使大鼠主動脈早期收縮與舒張能力均降低，動脈環(huán)最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小。

高脂血癥; 動脈環(huán)張力; 動脈粥樣硬化; SD大鼠

動脈環(huán)張力主要反映動脈舒張功能的狀態(tài)及彈性功能, 在一定程度上能反映動脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能[1],內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害往往是心血管疾病如動脈粥樣硬化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。高脂血癥是動脈粥樣硬化的誘發(fā)因素之一，本實驗通過建立大鼠高脂血癥模型和動脈粥樣硬化模型，應(yīng)用離體動脈環(huán)張力測定的方法，探討血脂對大鼠腹主動脈環(huán)張力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及模型制備

清潔級雄性SD大鼠40只, 體質(zhì)量230～270 g,由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2007-0005]。隨機分為4組: 高脂飲食4周組(T1組)10只, 飼料中含1.3%膽固醇、16.4%豬油、0.3%膽鹽、10%蔗糖、8.5%酪蛋白、1.6%預(yù)混料、1.9%麥芽糊精、60%繁殖鼠料喂養(yǎng), 誘發(fā)高脂血癥模型; 對照組(C1組)10只, 用普通飼料喂養(yǎng)4周; 高脂飲食12周組(T2組)10只, 飼料成分同T1組, 誘發(fā)動脈粥樣硬化模型; 對照組(C2組)10只, 用普通飼料喂養(yǎng)12周。4組大鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部[SYXK(滬)2008-0051]。

1.2 血生化檢查

實驗前分別對4組大鼠的體質(zhì)量、身長進行檢測，并采用日本SOFTRON公司BP-98A型智能無創(chuàng)血壓計通過尾套法測量大鼠的基礎(chǔ)血壓(收縮壓Ps及舒張壓Pd)，記錄數(shù)值(圖1)。

在空腹?fàn)顟B(tài)下，經(jīng)心臟采血4 ml，檢測4組大鼠的血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)。于4周后獲取T1組及C1組的血生化指標(biāo);12周后獲取T2組及C2組的血生化指標(biāo)。

1.3 儀器和方法

實驗4周后, 根據(jù)1 ml/300g的劑量于T1及C1組大鼠的腹腔內(nèi)注射水合氯醛適量(實驗12周后，T2及C2組大鼠重復(fù)以下步驟)，在麻醉狀態(tài)下切開大鼠胸腹腔，分離出腹主動脈，放入預(yù)冷的改良 Kreb’s液中(NaCl 118 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L, NaHCO325 mmol/L，Glu 11.1mmol/L,10% NaOH滴定至pH 7.4)，仔細(xì)剔除血管周圍脂肪和結(jié)締組織，剪成2～3 mm長的血管環(huán)，殘余腹主動脈段待送病理。將主動脈環(huán)置于DMT 610M multi-wire myograph system四通道微血管張力測定系統(tǒng)(丹麥)的每個獨立單元，即一個5 ml不銹鋼浴槽中，用專用針式固定架將血管固定在浴槽中。槽內(nèi)改良Kreb’s液，通以O(shè)2-C02混合氣(體積分?jǐn)?shù)分別為0.95和0.05)，溫度維持在37℃。固定架的一端與張力傳感器相連，另一端與微固定器相連，使用血管正?；绦虼_定血管被動的長度-張力關(guān)系，記錄血管張力。

圖 1 大鼠血壓的標(biāo)準(zhǔn)曲線

調(diào)節(jié)靜息張力2 g，平衡60 min。平衡結(jié)束后，用60 mmol/L高鉀Kreb’s溶液預(yù)刺激血管2次，每次15 min，期間用Kreb’s液洗脫，記錄第二次刺激的最大收縮張力值。用Kreb’s液洗脫之后，給予1 μmol/L苯腎上腺素(Phenylephrine, Phe)，至最大收縮張力后，記錄下苯腎上腺素最大收縮張力值; 再給予1 μmol/L乙酰膽堿(Ach)，至最大舒張?zhí)?，記錄每一動脈環(huán)的最大收縮(或舒張)張力值。以Phe或高K溶液誘發(fā)最大收縮幅度為100%，加入Ach后的血管張力幅度與誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化(圖2)。最大舒張百分比=(苯腎上腺素最大收縮張力值-乙酰膽堿最大舒張張力值)/苯腎上腺素最大收縮張力值×100%。

1.4 病理學(xué)檢查

4組大鼠均取殘余腹主動脈，每段約5 mm，沿動脈長軸縱行剖開，用冰鹽水沖洗后，貯存于4%中性甲醛溶液中固定24 h以上，待常規(guī)脫水、浸蠟，包埋成蠟塊，行HE染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。組間比較運用單因素ANOVA 法；2組間比較運用非配對t檢驗法; 兩變量相關(guān)分析運用Pearson相關(guān)檢驗和Spearman等級相關(guān)檢驗; 簡單線性回歸分析運用Stepwise模型選擇法多元逐步線性回歸模型進行。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 2 大鼠主動脈環(huán)的收縮舒張反應(yīng)曲線

表 1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

表 2 大鼠動脈環(huán)張力參數(shù)的比較

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)的比較

4組大鼠間基礎(chǔ)值比較, TC、TG、HDL、LDL、體質(zhì)量、身長、收縮壓及舒張壓的差異均無顯著性意義(P＞0.05)。實驗后比較, T1組大鼠的TC及LDL明顯高于對照組C1(P＜0.001; P=0.001), T2組大鼠的收縮壓、TC、TG、LDL及HDL均明顯高于C2組(P均＜0.05), T2組的收縮壓、舒張壓及TG明顯高于T1組(P均＜0.05)(表1)。對照C1組與C2組間大鼠的各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 血管環(huán)肌張力參數(shù)的比較

T1組的高鉀溶液最大收縮張力值、苯腎上腺素最大收縮張力值及最大舒張百分比顯著低于C1組(P＜0.001; P＜0.01; P=0.001)。T2組的高鉀溶液最大收縮張力值及苯腎上腺素最大收縮張力值顯著高于C2組(P＜0.05; P＜0.05)，最大舒張百分比顯著低于C2組(P＜0.001)。而T2組與T1組比較，高鉀溶液最大收縮張力值及苯腎上腺素最大收縮張力值顯著高于T1(P＜0.001; P＜0.05)，最大舒張百分比在兩組間比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

2.3 相關(guān)性分析

苯腎上腺素最大收縮張力值與高鉀溶液最大收縮張力值、甘油三酯呈顯著正相關(guān)(r=0.707, P＜0.001;r=0.435, P＜0.05)(表3)。最大舒張百分比和收縮壓、TC及LDL呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318, P=0.046;r=-0.449, P=0.004; r=-0.411, P=0.008), 和HDL呈顯著正相關(guān)(r=0.324, P=0.041)(表4)。

2.4 簡單線性回歸分析

TC是最大舒張百分比的獨立危險因素(β=0.381,P=0.010)。

2.5 病理學(xué)觀察

光鏡顯示: C1、C2組大鼠的腹主動脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)光整，內(nèi)皮細(xì)胞下連接緊密、間隙窄，內(nèi)膜平坦。中膜彈力纖維結(jié)構(gòu)清晰，呈波浪狀排列。外膜較薄，為疏松結(jié)締組織(圖3A); T1組大鼠腹主動脈壁層次尚清晰，內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，內(nèi)皮下可見少量泡沫細(xì)胞堆積(圖3B); 而T2組大鼠的腹主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜明顯增厚，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，斑塊表面為纖維帽，其下有脂質(zhì)沉積，深部為壞死物質(zhì)，中膜明顯受壓萎縮，呈較成熟的動脈粥樣硬化斑塊(圖3C)。

表 3 Phe最大收縮張力值的相關(guān)性分析

表 4 最大舒張百分比的相關(guān)性分析

圖 3 大鼠腹主動脈病理學(xué)觀察

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生與脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，其本質(zhì)是動脈壁對從血漿侵人脂質(zhì)的反應(yīng)，長期高脂膳食可導(dǎo)致血脂濃度異常升高。本組資料中，大鼠經(jīng)4周高脂膳食后，血清TC及LDL明顯增高，提示高脂血癥模型成功建立，與文獻報道一致[2]。12周后，血清TC、TG、LDL、HDL均較對照組顯著升高，病理提示腹主動脈內(nèi)膜增厚，可見動脈粥樣斑塊形成，提示動脈粥樣硬化模型成功建立。其中，LDL值與高脂飲食4周后比較雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但LDL值確有隨病程延長而增高的趨勢。也符合文獻報道的“LDL與動脈粥樣硬化呈顯著正相關(guān)”[3]。

關(guān)于采用體外離體動脈環(huán)張力實驗來測試血脂水平對動脈環(huán)收縮和舒張功能的影響, 國內(nèi)外有相關(guān)報道。由于高鉀溶液及苯腎上腺素都能誘導(dǎo)血管收縮, 只是機制不同[4～5]。而乙酰膽堿為內(nèi)皮依賴和受體依賴性舒張血管物質(zhì), 內(nèi)皮源性NO介導(dǎo)其舒張血管作用, 可以反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能變化[6], 故本實驗參照Mulvany等[7]描述的方法進行實驗, 最終發(fā)現(xiàn)T1組大鼠腹主動脈環(huán)的收縮能力和舒張能力較正常對照組均下降, 這與蔡波等[2]的研究結(jié)果相符。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞下有少量泡沫細(xì)胞堆積，提示早期動脈硬化。進一步證明了高脂飲食使大鼠主動脈早期收縮與舒張能力均降低的機制，可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及血管舒張功能的異常與內(nèi)皮釋放血管舒張因子(EDRF/NO)障礙有關(guān)[8～9]。

本實驗中動脈粥樣硬化模型組的腹主動脈環(huán)的最大收縮張力值明顯大于對照組及高脂模型組，推測可能是動脈發(fā)生粥樣硬化時，由于內(nèi)皮的嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮釋放ET增加，因此使主動脈對高鉀溶液及苯腎上腺素的收縮反應(yīng)增強，引起血管張力紊亂。然而，T2組的最大舒張百分比顯著低于對照組，說明動脈硬化程度越嚴(yán)重，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度越嚴(yán)重，動脈環(huán)的張力越紊亂，動脈環(huán)的舒張能力越差。

本實驗結(jié)果顯示，T2組與T1組在最大舒張百分比的比較時，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義?？赡苁潜緦嶒炛袆游锬Ｐ徒⒌臅r間較短，其斑塊雖已形成，但對動脈環(huán)舒張功能的影響可能與人類動脈粥樣硬化時對血管的影響不完全一致。臨床慢性硬化病變時間較長，可能已有膠原纖維的增多，彈性纖維減少甚至消失，中膜平滑肌萎縮，對動脈僵硬度影響較大。

此外，相關(guān)分析結(jié)果表明，最大舒張百分比和收縮壓、TC及LDL呈顯著負(fù)相關(guān), 和HDL呈顯著正相關(guān)。因此，動脈環(huán)最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小，血脂的水平對動脈環(huán)張力的影響是顯而易見的。即在動脈粥樣斑塊還沒形成之前，血脂水平的高低對動脈環(huán)的張力就產(chǎn)生了影響，使動脈收縮和舒張功能均降低。當(dāng)有明顯的動脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)時，動脈環(huán)的張力發(fā)生了明顯變化，內(nèi)皮功能的損害為最大舒張百分比的顯著減小提供了有力的病理學(xué)診斷基礎(chǔ)，表明內(nèi)皮依賴性舒張功能降低出現(xiàn)于斑塊形成之前，符合先功能，后形態(tài)的病變過程。

本研究表明，高脂飲食使大鼠腹主動脈早期收縮與舒張能力均降低，致動脈硬化期動脈的收縮功能反而增高；腹主動脈環(huán)的最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小，并隨著高密度脂蛋白水平的減低而減小。

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Effects of High Fat Diet on Arterial Ring’s Tension in SD Rats

ZHANG Yi1, ZHAN Wei-wei1, WU Yong-ji2, ZHOU Wu-gang2, CHEN Dong-rui2, JIANG Wei-min3, ZHENG Lin3
(1. Department of Ultrasound, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China; 2. Shanghai Institute of Hypertention,Shanghai 200025, China; 3. Department of Pathology,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo observe the changes of arterial ring’s tension in SD rats with hypercholesterolemia and atherosclerosis.MethodsIn vitro isometric tention experiment was used to measure arterial ring’s maximum contractile tension, arterial ring’maximum relaxation pencentage of the aorta in cholesterol-fed SD Rats (group T1, n=10, for 4 weeks; group T2, n=10, for 12 weeks) and normal control rats(group C1, n=10; group C2, n =10). All parameters and blood biochemical markers(total cholesterol, triglycerides, low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol)among groups were analyzed with ANOVE factor analysis.Correlation was analyzed with Pearson analysis.Light microscopic evaluation was used to demonstrate atherosclerotic changes in the aorta.ResultThe maximum contractile tension value to KCl and phenephrine and the maximum relaxation pencentage of the aorta in group T1 were significantly lower than those of group C1 controls (P＜0.05). The maximum relaxation pencentage of the aorta in group T2 rats were significantly lower than those of group C2 controls (P＜0.05). The maximum contractile tension value to KCl and phenephrine in group T2 were significantly higher than those of group T1(P=0.001, P＜0.05). However, no significances were found with the maximum relaxation percentage in group T1 and T2 (P＞0.05). Correlation analysis shows: the maximum contractile tension value of the aorta was positively correlated with triglycerides (r=0.435,P＜0.05). The maximum relaxation pencentage of the aorta was negatively correlated with systolic pressure,total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (r=-0.318, P=0.046, r=-0.449, P=0.004;r=-0.411, P=0.008), also it was negatively correlated with high-density lipoprotein cholesterol(r=0.324,P=0.041). Light microscopy confirmed morphologic typical changes of aortic atherosclerosis in group T1 and T2. Conclution High fat diet will lower the ability of rats’s arterial contraction and relaxation in earlier state. The maximum relaxation percentage was much lower associated with the increasement of total cholesterol and low density lipoprotein.

Hypercholesterolemia; Arterial ring’s tension; Atherosclerosis; SD rats

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0126-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.009

2013-09-09

張 怡(1976-), 女, 碩士, 主治醫(yī)師, 從事超聲診斷工作; E-mail: cheri_zhangsh@hotmail.com

詹維偉, 男, 主任醫(yī)師, 碩士研究生導(dǎo)師,E-mail: shanghairuijin@126.com