鄧麗麗, 臧家娜, 應(yīng)華忠, 余陳歡, 俞 冰

(1. 淅江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 杭州 310053; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310013)

熱休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纖維化過(guò)程中的作用

鄧麗麗1, 臧家娜1, 應(yīng)華忠2, 余陳歡2, 俞 冰1

(1. 淅江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 杭州 310053; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310013)

目的 探討熱休克蛋白70(HPS70)在兔非酒精性脂肪肝(NAFLD)纖維化形成過(guò)程中的作用。方法 40 只雄性日本大耳兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組和NAFLD模型組，其中對(duì)照組取8周為時(shí)相點(diǎn)，模型組取4周、6周、8周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各10只。模型組分別皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周，每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。按時(shí)間點(diǎn)處死各組動(dòng)物，測(cè)定兔血清中ALT、AST、TC、TG、FFA、空腹血糖(FBG)、HSP47、HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN的含量和空腹胰島素(FINS)的水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR); MASSON染色觀察肝組織病理形態(tài)改變; 免疫組化觀察HSP47和HSP70的表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組肝功能、脂質(zhì)代謝和肝纖維化相關(guān)指標(biāo)水平升高，造模4周時(shí)出現(xiàn)肝功能損傷，脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗，隨著NAFLD肝纖維化進(jìn)程的發(fā)展，HSP70表達(dá)量逐漸增加。結(jié)論 HSP70的表達(dá)與NAFLD肝纖維化程度呈正相關(guān)，可能與NAFLD肝纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

非酒精性脂肪肝; 肝纖維化; 熱休克蛋白70; 胰島素抵抗

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床十大非傳染性疾病之一[1～2]。依據(jù)病變肝組織中是否伴有炎癥反應(yīng)和纖維化，NAFLD可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化[3]，其中NAFLD肝纖維化作為NAFLD臨床病理發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)亞型，是NAFLD進(jìn)展為肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段[4]。肝纖維化的發(fā)生并不是一個(gè)單一因素參與的過(guò)程，而是一種多基因、多因素、多途徑共同參與的過(guò)程；這些因素互相影響、互相交叉，共同形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[5]。HSPs是一種免疫蛋白，它既能通過(guò)模式識(shí)別受體激活先天免疫系統(tǒng)啟動(dòng)或促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)作為前膠原的“分子伴侶”，參與機(jī)體內(nèi)膠原合成，是膠原成熟的必要條件，它的表達(dá)影響膠原的產(chǎn)量[6]，表明其可能與纖維化形成有聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，HSPs家族的HSP47與HSP70都與形成多種纖維化有關(guān)，但與肝纖維化的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兔皮下注射花生油建立NAFLD模型，動(dòng)態(tài)檢測(cè)兔NAFLD肝纖維化過(guò)程中HSP70在肝組織中的表達(dá)，以探討HSP70在肝纖維化發(fā)展中的作用，也為該模型在脂肪肝發(fā)病機(jī)制方面提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性日本大耳兔40只，體質(zhì)重2.0±0.2 kg。由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(浙)2009-0039];所有實(shí)驗(yàn)均在浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(浙)2008-0114]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、游離脂肪酸(FFA)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所; 兔生物指標(biāo)ELISA試劑盒，均購(gòu)于上海拜沃公司; 花生油(飽和脂肪酸: 單不飽和脂肪酸: 多不飽和脂肪酸=0.27∶1∶1)，購(gòu)于東莞市鵬發(fā)糧油有限公司; 其余所用試劑均為分析純。723N型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科技有限公司; DM2500型熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，萊卡儀器有限公司; 三諾安穩(wěn)血糖儀，長(zhǎng)江三諾生物傳感技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及造模 將日本大耳兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組和NAFLD模型組, 其中正常對(duì)照組取8周為時(shí)相點(diǎn)，模型組取4周、6周、8周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各10只。模型組分別皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周, 每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。正常對(duì)照組隔天注射同體積的生理鹽水。

1.3.2 取材 各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物均于末次注射后禁食12 h,耳動(dòng)脈取血，速眠新麻醉后頸動(dòng)脈放血處死。以3 500 r/min，離心10 min，分離血清-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ⊥徊课桓谓M織裝于10%中性甲醛中固定，用于病理切片。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 采用血糖儀測(cè)定空腹血糖(FBG)，采用比色法測(cè)定血清ALT、AST、TC、TG、FFA含量。采用ELISA法測(cè)定血清中熱休克蛋白47(HSP47)、熱休克蛋白70(HSP70)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)、胰島素(FINS)含量測(cè)定。具體操作步驟均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

胰島素抵抗指數(shù)(HOMA- IR)= FINS×FBG/22.5

1.3.4 病理學(xué)觀察 石蠟包埋肝組織標(biāo)本制備4 μm切片, Masson染色, 光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.5 免疫組織化學(xué)分析 免疫組化觀察HSP47和HSP70在肝組織表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以x-± s表示，以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間有差異用t檢驗(yàn)，組間沒(méi)有差異用秩和檢驗(yàn)。雙變量正態(tài)分布資料采用Pearson相關(guān)分析，不服從雙變量正態(tài)分布或等級(jí)變量資料相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo)的分析

與對(duì)照組相比較, 模型組各時(shí)間段血清中ALT、TC、FFA的值均升高, 有顯著性差異(P＜0.01),FBG、FINS、HOMA-IR在第4周出現(xiàn)升高，到第8周達(dá)到最大值，且顯時(shí)間依賴(lài)性(表1)。表明造模4周后出現(xiàn)肝功能損傷，高脂，胰島素抵抗，且隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。

各組兔肝纖維相關(guān)指標(biāo)見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比較，模型組各時(shí)間段血清中HSP47無(wú)顯著性差異，但HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN值顯著升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明模型組兔在造模4周后即發(fā)生明顯的纖維化，且隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而加重纖維化程度。

2.2 肝組織病理形態(tài)觀察

肉眼觀察對(duì)照組兔肝臟無(wú)明顯異常，模型組兔第4周肝臟為色紅，質(zhì)脆。6～8周肝臟被膜緊張、邊緣圓鈍、切面油膩、色淡黃，表面有花斑，質(zhì)軟。Masson染色檢查，觀察到正常對(duì)照組兔肝組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核大而清晰，胞質(zhì)豐富，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死，無(wú)膠原纖維。模型組4周兔肝組織呈輕度脂肪病變，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的脂肪空泡，并在匯管區(qū)、匯管區(qū)周?chē)?、纖維間隔內(nèi)可見(jiàn)少量纖維組織增生(被藍(lán)染)，出現(xiàn)纖維化; 模型6周組兔肝組織細(xì)胞出現(xiàn)腫脹多于4周組，細(xì)胞核大小不均，被脂肪空泡擠向一側(cè)，纖維化擴(kuò)展到門(mén)管區(qū)；模型8周組絕大部分肝細(xì)胞有脂肪空泡，纖維化擴(kuò)展到門(mén)管區(qū)周?chē)市敲罘派?圖1)。表明隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，兔肝組織的纖維化程度進(jìn)一步加重。

表 1 NAFLD肝纖維化兔血清生化指標(biāo)的變化(n=10)

表 2 NAFLD肝纖維化兔血清肝纖維相關(guān)指標(biāo)的變化(n=10)

2.3 免疫組織化學(xué)分析

HSPs表達(dá)物呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)照組可見(jiàn)肝細(xì)胞質(zhì)中有少量HSPs表達(dá)，其中HSP47的表達(dá)在不同時(shí)間相點(diǎn)模型中棕黃色分布幾乎相同(圖2)，表明HSP47在NAFLD肝纖維化進(jìn)程中表達(dá)量無(wú)顯著性變化。而HSP70則隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而棕黃色分布增多，顏色加深(圖3)，表明HSP70在NAFLD肝纖維化進(jìn)程中表達(dá)量有顯著性變化，表達(dá)量逐漸增加。

2.4 相關(guān)性分析

分析實(shí)驗(yàn)兔HSP47與HSP70對(duì)肝纖維化的影響。采用Image-Pro Plus 4.0分析軟件對(duì)NAFLD兔肝組織HSPs進(jìn)行光密度值分析、多元線性分析[7～8],HSP70與HA、PCⅢ成呈正相關(guān)(P＜0.05)，與CⅣ和LN無(wú)相關(guān)性(表3)。而HSP47與肝纖維化指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。以上結(jié)果表明HSP47與肝纖維化的形成發(fā)展無(wú)顯著影響，而HSP70與油脂誘導(dǎo)兔肝纖維化的形成有關(guān)。

表 3 HSPs與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性分析(n=40)

圖 1 兔肝組織病理學(xué)觀察(MASSON 染色, ×200)

圖 2 HSP47在兔NAFLD肝纖維肝組織表達(dá)情況(免疫組化×200)

圖 3 HSP70在兔NAFLD肝纖維化肝組織表達(dá)情況(免疫組化×200)

3 討論

3.1 皮下注射花生油造模

NAFLD肝纖維化動(dòng)物模型的建立對(duì)研究肝硬化的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療是重要的前提。目前，建立肝纖維化模型的方法主要有以下幾種: 四氯化碳(CCl4)誘發(fā)法、二甲基亞硝胺法、免疫誘發(fā)法、血吸蟲(chóng)感染法，酒精誘導(dǎo)法、高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)法。其中CCl4誘導(dǎo)的肝纖維模型應(yīng)用最早、最廣泛，具有特性明確、形成性好，復(fù)制率高等優(yōu)點(diǎn)，但其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，為8周到4個(gè)月不等，且死亡率高，與臨床NAFLD肝纖維化復(fù)雜的脂質(zhì)調(diào)控機(jī)制相去甚遠(yuǎn); 同時(shí)，目前NAFLD研究最常用的大鼠模型在血脂代謝方面也與人類(lèi)NAFLD特征有所區(qū)別[9～10]，存在高脂耐受的特點(diǎn)，極難形成肝纖維化，需連續(xù)高脂飼養(yǎng)6月以上方能少量形成NAFLD肝纖維化，存活率不足10%[11]?；ㄉ褪侨藗冏畛Ｓ玫氖秤糜椭? 具有熱量高, 脂肪量大等特點(diǎn), 日本大耳兔對(duì)致病膽固醇膳食的敏感性高。本實(shí)驗(yàn)選用花生油成功建立了肝纖維兔模型，成活率100%, 皮下注射花生油4周后兔肝組織MASSON染色呈輕度脂肪病變, 出現(xiàn)纖維化, 血清指標(biāo)ALT、TC、FFA、HA、PCIII、CIV、LN值均顯著升高，伴有脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗等癥狀，到第8周已完全形成NAFLD肝纖維化。

與傳統(tǒng)方法比較，花生油皮下注射誘導(dǎo)日本大耳兔建立NAFLD動(dòng)物模型，具有造模時(shí)短、肝臟取材量大，死亡率低、便于實(shí)時(shí)采血等優(yōu)點(diǎn)，可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。因此本實(shí)驗(yàn)的造模方法為快速、可靠地篩選NAFLD藥物提供一種新的實(shí)驗(yàn)工具。

3.2 NAFLD纖維化機(jī)制初步分析

熱休克蛋白(HSPs)是組織細(xì)胞受到外界因素刺激后應(yīng)激產(chǎn)生的一種物質(zhì)，是免疫應(yīng)激和信號(hào)通路共同識(shí)別的生物標(biāo)志物，在進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性和同源性。以HSPs為中心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最活躍的主題之一，也是機(jī)體各種器官纖維化發(fā)生、發(fā)展及其復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)[12～13]，它既能通過(guò)模式識(shí)別受體激活先天免疫系統(tǒng)啟動(dòng)或促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)作為前膠原的“分子伴侶”, 參與膠原合成, 是膠原成熟的必要條件, 其表達(dá)影響膠原的產(chǎn)量, 能引導(dǎo)效應(yīng)因子與Wnt蛋白結(jié)合而開(kāi)啟Wnt通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。

研究發(fā)現(xiàn)HSP47在各種器官膠原異常聚集的纖維性疾病中均有所表達(dá)增加，如肺纖維化、心肌梗塞、腎小球腎炎等[15～16]，提示HSP47與器官的纖維化疾病進(jìn)程有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NAFLD肝纖維化的進(jìn)程中HSP47的表達(dá)并沒(méi)有顯著性變化，反而HSP70表達(dá)逐漸增加，并且與HA、PCⅢ的含量隨NAFLD肝纖維化的進(jìn)程增加的趨勢(shì)一致。提示在NAFLD肝纖維化中，HSP70作為主導(dǎo)作用促進(jìn)HA和PCⅢ的形成而形成肝纖維化。同時(shí)HSP70又具有肝保護(hù)作用，國(guó)外研究顯示[17]，在急性肝損傷動(dòng)物模型中HSP70對(duì)肝組織細(xì)胞有保護(hù)及再生的作用。因此可認(rèn)為HSP70在NAFLD肝纖維化中既有保護(hù)肝細(xì)胞作用，又有促進(jìn)肝纖維形成作用, 隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng), 機(jī)體組織超出一定的恢復(fù)期，HSP70失去其保護(hù)作用, 其促纖作用占主導(dǎo)地位，加重肝纖維化。綜上所述，HSP70在NAFLD肝纖維化發(fā)展過(guò)程起重要作用, 可作為NAFLD肝纖維機(jī)制研究中的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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Effect of HSP70 on Fibrosis of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rabbits

DENG Li-li1, ZANG Jia-na1, YING Hua-zhong2, YU Chen-huan2, YU Bing1
(1. Pharmaceutical College, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China;2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Zhejiang Center of Laboratory Animals, Hangzhou 310013, China)

ObjectiveTo investigate the change of HSP70 in nonalcoholic fatty (NAFLD) liver fibrosis of rabbit.MethodsForty male Japanese white rabbits were randomly assigned to control group and model group. The model group was divided into three subgroups, as 4-week, 6-week, 8-week groups, with 10 rabbits in each, and treated with peanut oil (1.2 ml/kg) subcutaneously (s.c.), twice a week for 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks respectively. The rabbits of all groups were sacrificed at the designed time point. Samples of serum were collected for detecting the serum ALT, AST, TC, TG, FFA,FBG, HSP47, HSP70, HA, PC?, C??, LN ,and the HOMA-IR were calculated. The liver tissues were collected for histopathological and immunohistochemical observation.ResultsThe model groups had hepatic injury and high level of insulin at the beginning of 4 weeks. With the process of NAFLD liver fibrosis, HSP70 had gradually increased.ConclusionThe expression of HSP70 was positively correlated with NAFLD liver fibrosis, and it might have close relation with the development of NAFLD liver fibrosis.

NAFLD; Liver fibrosis; HSP70; HOMA-IR

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0107-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.006

2013-10-30

鄧麗麗(1965-), 女, 碩士研究生, 從事疾病動(dòng)物模型脂質(zhì)代謝研究, E-mail: denglili485@sohu.com

俞 冰(1965), 女, 副教授, 從事疾病動(dòng)物模型脂質(zhì)代謝研究, E-mail: yhz0796@sina.com