李 丹 郭小梅 李宏蓮 楊曉云＊

（1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科；2華中科技大學同濟醫(yī)學院組織學與胚胎學系，武漢430030）

自噬現(xiàn)象是依賴于溶酶體將體內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)與細胞器吞噬清除的一種保守的代謝方式。當營養(yǎng)物質(zhì)短缺時，體內(nèi)可通過自噬過程消耗自身胞漿中的細胞器來滿足能量的需求從而維持機體的穩(wěn)態(tài)。但是，自噬過程的過度激活會導致細胞的死亡，大量的研究已表明自噬體的產(chǎn)生增多與心室重構(gòu)、心力衰竭和心肌缺血密切相關(guān)［1］。在機體產(chǎn)生自噬的過程中，線粒體的融合與分裂發(fā)揮著重要的作用，特別是線粒體的分裂，線粒體膜電位的降低在機體通過選擇性自噬降解線粒體的過程中尤為關(guān)鍵［2］。Mfn－2是近年來發(fā)現(xiàn)的分布于線粒體外膜，與線粒體融合與分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)，而且已有研究報道Mfn－2在心肌細胞的自噬溶酶體形成過程中起核心功能，心肌細胞缺乏 Mfn－2時會導致自噬體的堆積，溶酶體的產(chǎn)生減少，最終導致心肌功能的受損［3］。平滑肌細胞的增殖在動脈粥樣硬化的產(chǎn)生和形成過程中發(fā)揮著重要的作用，但是Mfn－2與平滑肌細胞中的自噬現(xiàn)象目前尚無研究，本研究中，我們將培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞（r VSMCs）中分別感染腺病毒載體 Adv－Mfn－2－SiRNA和空載 Adv－Lac－Z作為實驗組和對照組，通過 Western Blot分析Mfn－2的表達，JC－1處理后運用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位的變化，透射電子顯微鏡顯示線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變以及自噬體的形成和積累過程探討Mfn－2降低對r VSMCs內(nèi)線粒體自噬的影響。

材料和方法

1.材料

1.1 細胞及腺病毒

Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞（r VSMCs）及 腺 病 毒 Adv－Mfn－2－SiRNA 和 Adv－Laz［由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）陳光慧教授惠贈］。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；HEPES（美國Sigma公司）；碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉（國藥集團化學試劑公司）；碘化丙啶、RNA酶、TEMED、EDTA、PVDF膜（美國Sigma公司）；胰酶、AP、丙烯酰胺、N，N－二甲基雙丙烯酰胺、Tris堿、SDS、HCl、Tris－HCl、甘油、溴酚藍、甘氨酸（美國Amersco公司）；5×上樣緩沖液（博士德生物）；甲醇（西隴化工股份有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；Mfn－2抗體（英國 Abcam 公司）；Tubulin（美國Sigma公司）；HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG／Ig M（美國 Cell Signaling Technology公司）；ECL顯色劑（美國BIPEC BIOREAGENT公司）；膠片、顯影液、定影液（美國 Kodak公司），多聚甲醛、Triton－X－100、戊二醛、鋨酸、乙醇、丙酮、環(huán)氧樹脂、醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛（西隴化工股份有限公司），JC－1線粒體膜電位檢測試劑盒（南京凱基）。

2.方法

2.1 實驗分組

Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，實驗選擇3至5代處于對數(shù)生長期的細胞，采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至50%豐度左右時，采用DMEM無血清培養(yǎng)基同步化48 h后，加入Adv－Mfn－2－SiRNA以感染復數(shù)60 pfu／細胞感染血管平滑肌細胞24 h作為實驗組，加入Adv－LaZ 60 pfu／細胞繼續(xù)維持24 h作為對照組。

2.2 免疫印跡分析

收集處理后的細胞，加入RIPA裂解液100 ml／每皿（100 mm），冰上裂解30 min；收集全部裂解液，4℃，12000 rpm離心15 min，收集上清；根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒配制標準蛋白樣品，分別取各組蛋白樣品5 ml，加入45 ml蒸餾水，稀釋10倍；分別取標準蛋白樣品和待測蛋白樣品各5 ml／孔和95 m LA－B液（VA∶VB＝50∶1）加入96孔板，每個樣品平行做3孔，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，ELX－800酶標儀490 nm讀數(shù)，記錄各組數(shù)值，根據(jù)標準蛋白樣品的OD490繪制標準曲線，再根據(jù)待測蛋白樣品的OD490值得算待測蛋白樣品濃度，待測蛋白樣品的原始濃度＝待測蛋白樣品計算的濃度×稀釋倍數(shù)（10倍）；制備SDS－PAGE凝膠和電泳緩沖液；將樣品依次上樣至梳齒孔，先用恒流（10 m A／膠）電泳，待指示劑電泳至堆積膠和分離膠的交界處時，改用恒壓 （100 V）電泳，直至指示劑完全跑出分離膠；采用PVDF膜，轉(zhuǎn)膜槽中倒入1× 轉(zhuǎn)膜緩沖液，在230 m A下轉(zhuǎn)印約2.5 h；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，室溫下用5%TBS－脫脂牛奶振蕩封閉1 h；加入用封閉液稀釋的一抗，4℃孵育過夜；用TBS洗膜后采用辣根過氧化物酶／化學發(fā)光檢測法曝光，顯影，定影，膠片晾干后，經(jīng)掃描儀掃描，Adobe Photoshop軟件轉(zhuǎn)換為TIFF格式后，Image J圖形軟件計算灰度值，進行半定量分析。

2.3 線粒體膜電位的檢測

將5 ml JC－1 stock solution加入800 ml雙蒸水中，待JC－1充分溶解后加入200 ml 5×染色液；2.0×105／ml的細胞密度將血管平滑肌細胞種植入6孔板內(nèi)，每孔加入2 ml，24 h后進行細胞周期誘導；胰酶消化后，每孔內(nèi)的細胞用1 ml培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移入流式管內(nèi)；加入準備的染色液，混勻；37℃避光水浴20 min；準備JC－1染色緩沖液，將400 ml 5×staining solution用雙蒸水稀釋至2 ml，冰上預(yù)冷；水浴后的細胞室溫600 g離心10 min，小心移去上清；用JC－1染色緩沖液200 ml／管重懸得到的細胞，冰浴保存，30 min內(nèi)上流式儀，在590／529nm檢測線粒體膜電位的變化。

2.4 常規(guī)透射電子顯微鏡成像

收集處理后的細胞，先將細胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中800轉(zhuǎn)／分5－10 min，再將細胞懸液置入1.5 ml Ep管中1500轉(zhuǎn)／分10 min，完畢后Ep管底的細胞團以一粒芝麻為宜，去除上清，沿管壁緩慢加入2.5%戊二醛緩沖固定液；2.5%戊二醛緩沖固定液固定2 h；0.1 mol／L磷酸緩沖液清洗2×20 min；1% 鋨酸后固定30至120 min；0.1 mol／L磷酸緩沖液清洗；按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮（2次）各5 min梯度脫水；丙酮與環(huán)氧樹脂1∶1混合半浸透2 h；純環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h；包埋；聚合（80℃恒溫箱內(nèi)）10 h；修塊；超薄切片（德國LEICA ULTRACUT UCT超薄切片機）；染色：醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色各10 min；透射電鏡（荷蘭FEI Tecnai G212型）觀察、拍照。

3.統(tǒng)計學分析

相關(guān)實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準誤表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，組間差異采用雙尾T檢驗，P＜0.05認為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后Mfn－2的表達變化

r VSMCs生長至50%豐度左右時，采用DMEM高糖培養(yǎng)基（不含血清）同步化4 8 h后加入Adv－LacZ作為對照組，免疫印跡半定量分析的結(jié)果表明，r VSMCs中 Mfn－2蛋白條帶與內(nèi)參Tubulin的相對灰度值為1.434±0.127（n＝3）；同步化48 h后腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA 以感染復數(shù)60 pfu／細胞感染r VSMCs 24 h，Mfn－2蛋白條帶與內(nèi)參Tubulin的相對灰度值為0.604±0.071（n＝3），Mfn－2的表達明顯降低（P＜0.05）。

圖1 r VSMCs同步化后加入腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA Mfn－2的表達較加入Adv－LacZ對照組明顯降低。Fig.1 The expression of Mfn－2 was inhibited evidently in the r VSMCs infected with Adv－Mfn－2－SiRNA after synchronization，compared with that with Adv－LacZ.

2.JC－1染色法檢測腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后線粒體膜電位顯著降低

Adv－Mfn－2－SiRNA 感 染 r VSMCs后，線 粒 體膜電位的值為4.977±1.672（n＝6），顯著低于對照組線粒體膜電位的值46.79±35.58（n＝6，P＜0.05）。

圖2 Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后線粒體膜電位顯著低于 Adv－Lac－Z感染組。（A）JC－1染色的陽性對照顯示CCCP處理后細胞大量死亡，從而與JC－1的單體結(jié)合位于右下象限（LR）；（B）對照組線粒體膜電位的分布；（C）實驗組線粒體膜電位的分布；（D）Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs前后線粒體膜電位變化的統(tǒng)計學差異（n＝6，P＜0.05）。Fig.2 JC－1 staining showed that the mitochondria membrane potential declined markly after adenoviral infection of Adv－Mfn－2－SiRNA.（A）The positive control of JC－1 staining showed that most of JC－1 monomer distributed in LR after treatment with CCCP.（B）The distribution of staining of J－aggregate and JC－1 monomer in the Adv－Lac－Z infection group.（C）The mitochondria membrane potential were stained by JC－1 in the Adv－Mfn－2－SiRNA infection group.（D）The significant differences of mitochondrial membrane potential between control and Adv－Mfn－2－SiRNA infection group（n＝6，P＜0.05）.

3.腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后自噬溶酶體的含量變化

r VSMCs同步化48 h后，采用腺病毒Adv－Mfn－2－SiRNA60 pfu／細胞感染24 h后，自噬溶酶體的數(shù)量即明顯增加。

圖3 腺病毒Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后自噬體的數(shù)量明顯增多。（A）同步化后加入Adv－LacZ，r VSMCs中自噬體的分布與含量；（B）同步化后加入腺病毒Adv－Mfn－2－SiRNA后，r VSMCs中自噬體的數(shù)量明顯增多（粗箭頭示自噬體，細箭頭示線粒體）。Fig.3 The autophagosome accumulated after the r VSMCs were infected with Adv－Mfn－2－SiRNA.（A）The distribution of autophagosome in the r VSMCs infected with Adv－LacZ after synchronization.（B）Accumulation of autophagosome were showed after the r VSMCs infected with Adv－Mfn－2－SiRNA after synchronization （Coarse show the autophagosome，fine show mitochondria）.

討 論

線粒體的自噬是細胞通過自噬機制選擇性清除線粒體的過程，線粒體在通過電子傳遞鏈生成ATP為機體供能的同時也會產(chǎn)生大量活性氧，導致線粒體過氧化損傷，線粒體在及時清除損傷的線粒體維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。線粒體自噬的異常與多種疾病密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、血液病、心血管疾病以及癌癥。因此，研究線粒體自噬的分子機制對于揭示這些疾病的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療藥物具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，線粒體融合與分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)也參與線粒體的自噬過程，線粒體分裂后通常會產(chǎn)生兩個不均勻的子代，其中部分線粒體能恢復膜電位，并與其他線粒體發(fā)生融合形成線粒體網(wǎng)絡(luò)，有些膜電位下降的線粒體就會選擇性被自噬清除。線粒體融合蛋白OPA1的高表達能抑制線粒體自噬的發(fā)生［4］，線粒體分裂蛋白Fis1的高表達以及它的一個突變體都能促進線粒體自噬的發(fā)生［5］。

此研究通過腺病毒感染大鼠血管平滑肌細胞的方法，采用腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA感染r VSMCs后發(fā)現(xiàn)，我們構(gòu)建的腺病毒 Adv－Mfn－2－SiRNA可顯著降低Mfn－2的表達，同時線粒體的膜電位下降，自噬體的產(chǎn)生明顯增多。我們的結(jié)果提示大鼠血管平滑肌細胞中Mfn－2表達的降低與自噬體的產(chǎn)生增加有關(guān)。曾有報道顯示，細胞在饑餓狀態(tài)下，線粒體可通過外膜的轉(zhuǎn)運來促進自噬體的形成［6］。Mfn－2主要分布于線粒體外膜，外膜參與自噬體的形成后，Mfn－2的表達降低，這與我們的結(jié)果也相吻合。

而且，近年來的研究也開始關(guān)注分布于線粒體外膜的線粒體融合蛋白與線粒體的自噬過程的密切關(guān)系。除前述心肌細胞缺乏Mfn－2時會導致自噬體的堆積，溶酶體的產(chǎn)生減少，最終導致心肌功能的受損外［7］，最新的研究也表明神經(jīng)系統(tǒng)疾病中線粒體融合蛋白與線粒體的自噬過程有關(guān)。正常情況下，線粒體的損傷導致線粒體融合蛋白的泛素化，從而促進PINK1基因以及下游的Parkin基因啟動自噬系統(tǒng)來清除損傷的線粒體，當PINK1基因或下游的Parkin基因突變后，可引發(fā)損傷線粒體的病理性堆積，這說明線粒體融合蛋白的降解有利于機體的自噬清除過程。研究表明在小鼠心肌細胞中Mfn－2也可介導PINK1／parkin依賴的線粒體自噬清除過程，parkin與 Mfn－2結(jié)合后，PINK1磷酸化 Mfn－2，從而促進parkin介導的Mfn－2泛素化，因此該研究提出Mfn－2是心臟線粒體外膜上parkin的受體，從而介導PINK1／parkin依賴的線粒體自噬清除過程［8］。

總之，我們的實驗發(fā)現(xiàn)大鼠血管平滑肌細胞中Mfn－2含量的降低會導致自噬體的增加，但是，其中到底是以自噬體為主還是以溶酶體為主，Mfn－2到底是以何種機制來介導平滑肌細胞內(nèi)的自噬體的形成和產(chǎn)生，以及大鼠血管平滑肌細胞中的這種自噬現(xiàn)象到底是促進動脈粥樣硬化的進展還是緩解尚需要進一步的研究。

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