方長清 姜海嬌 李鄉(xiāng)南 李宏強(qiáng) 祝 迪 李建華

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室； 2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，沈陽110001）

腦轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤常見的并發(fā)癥之一，通常約有20%的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，50%－80%的小細(xì)胞肺癌 （SCLC）患者，15%的乳腺癌患者，20%－50%的惡性黑色素瘤患者，4%的結(jié)直腸癌患者會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移［1］。其中，肺癌是最常見的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤［2］?；颊叱Ｒ蝾^痛，惡心，嘔吐，視物模糊等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主訴而就診，而無明顯呼吸系統(tǒng)癥狀。通常，在CT引導(dǎo)下行肺部穿刺術(shù)可證實原發(fā)病灶。肺癌生長速度快，且肺組織血供相當(dāng)豐富，癌細(xì)胞易經(jīng)肺靜脈進(jìn)入體循環(huán)，隨頸動脈或椎基底動脈上行到腦組織后形成轉(zhuǎn)移灶。研究表明，肺癌具有噬神經(jīng)組織的特性，對中樞神經(jīng)組織特別具有親和力［3］。在一些原發(fā)肺癌患者中，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤先于肺內(nèi)原發(fā)灶被發(fā)現(xiàn)，故稱為“腦先型”。有作者統(tǒng)計，腦轉(zhuǎn)移瘤先于肺癌確診的病例約占5%－10%［4］。因此，腦脊液中檢測癌細(xì)胞是臨床診斷腫瘤腦轉(zhuǎn)移的重要方法及可靠依據(jù)。

本文選擇了相對特異及敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，VEGF和淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2＿40及b－FGF在惡性腦脊液中進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，探討這些因子在肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的重要作用并證實腦脊液中腺癌細(xì)胞具有向脈管樣結(jié)構(gòu)分化生長的潛能，有助于探討轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。

材料和方法

1.研究對象

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年1月至2013年6月門診及病房患者腦脊液標(biāo)本109例，作為研究對象。其中，肺腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞標(biāo)本107例（包括49例肺癌術(shù)后5年內(nèi)腦轉(zhuǎn)移，58例無肺癌病史直接經(jīng)腦脊液穿刺發(fā)現(xiàn)肺癌腦轉(zhuǎn)移），乳腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞標(biāo)本2例。另外40例腦脊液（診斷為炎性）、40例肺腺癌組織標(biāo)本作為對照。男性患者114例，女性患者75例；年齡17－83歲，平均年齡59歲；全部病例經(jīng)病理學(xué)診斷及臨床診斷。

2.試驗試劑及方法

兔抗人 CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，b－FGF，VEGF及Vimentin抗體購自美國Biox公司。采用鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶（streptavidin－peroxidase，SP）法，PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

3.TCT涂片及石蠟切片的制備

采用液基細(xì)胞薄層方法（TCT）常規(guī)制片、診斷為腺癌細(xì)胞后，每份標(biāo)本制備9張涂片，分別做CK7，TTF－1，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，b－FGF，VEGF及vimentin的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。原發(fā)性腺癌術(shù)后標(biāo)本40例，常規(guī)石蠟組織包埋，石蠟切片4μm，每份標(biāo)本制備9張切片，分別做CK7，TTF－1，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，VEGF，b－FGF及vimentin的免疫組織化學(xué)染色。

4.結(jié)果的判定

以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性程度判斷：細(xì)胞無著色或著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)＜10%為（－）；陽性著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)10%－25%為（＋）；26%－50%為（＋ ＋），≥51%為（＋ ＋ ＋）；陽性表達(dá)即＋ ～ ＋ ＋ ＋。每張切片選取10個高倍視野（＊400），對免疫化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評估。

5.統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)的陽性率比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

使用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對腦脊液TCT涂片進(jìn)行CK7、TTF－1染色，陽性表達(dá)證實為肺腺癌細(xì)胞（圖1A、B、C）。在109例惡性腦脊液中，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ的陽性率分別為64.2%，67.9%，66.9%（圖2 A、B、C）。作為淋巴管特異性內(nèi)皮標(biāo)記物，D2－40也有表達(dá)，有51（46.8%）例結(jié)果為陽性（圖3 A），說明轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞也具有形成淋巴管的潛力。與前幾種抗體相比，b－FGF的陽性率較低，為56.8%（圖3 B）。在109例陽性腦脊液標(biāo)本中，有70例標(biāo)本發(fā)現(xiàn)VEGF胞漿陽性，陽性率為70.6%（圖3 C）。vimentin在腦脊液轉(zhuǎn)移腺癌細(xì)胞中陽性表達(dá)（圖3 D），表達(dá)率為88.1%。各標(biāo)記物在炎性腦脊液對照組中均無陽性表達(dá)（圖3 E）。在原發(fā)肺癌標(biāo)本中，VEGF，CD34，CD105和FⅧ表達(dá)較弱或不表達(dá)，D2－40在癌中不表達(dá)（圖4 C－G）。b－FGF與Vimentin在原發(fā)肺腺癌中的表達(dá)率分別為50.1%和29.3%。與對照組相比，各種標(biāo)記物在腦脊液轉(zhuǎn)移癌中的陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 A－C：TCT涂片、CK7和TTF－1在腦脊液中腺癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)（×60）Fig.1 A－C：TCT、CK7 and TTF－1 positive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）

圖2 A－C：CD34、CD105及FⅧ在腦脊液中腺癌細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)（×60））Fig.2 A－C：CD34、CD105 and FⅧpositive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）

圖3 A－D：D2－40、b－FGF、VEGF及Vimentin在腦脊液中腺癌細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)（×60）E：炎性腦脊液中各因子陰性表達(dá)（×60）Fig.3 A－D：D2－40、b－FGF、VEGF and Vimentin positive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）E：Each factors negative expression of infammatory cerebrospinal fluid（×10）

圖4 在肺穿刺的肺腺癌組織中的免疫組織化學(xué)染色，A－B：CK7和TTF－1的陽性表達(dá)（×40）；C－E：VEGF、CD34、CD105陰性表達(dá)（×40）；F：FⅧ弱陽性表達(dá)（×60）；G：D2－40陰性表達(dá)（×40）Fig.4 Immunohistochemistry of lung adenocarinoma of lung puncture.A－B：CK7 and TTF－1 positive expression（×40）；C－E：VEGF、CD34、CD105 negative expression（×40）F：FⅧ weakly positive expression（×60）；G：D2－40 negative expression（×40）

討 論

肺癌是腦轉(zhuǎn)移瘤中最常見的原發(fā)瘤，腦轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在癌癥的晚期，肺癌腦轉(zhuǎn)移的血行轉(zhuǎn)移過程比較快捷，肺癌細(xì)胞可以直接進(jìn)入動脈循環(huán)，隨血流進(jìn)入腦部。循環(huán)中存活的肺癌細(xì)胞停滯在腦血管床，才有進(jìn)入腦實質(zhì)存活的可能，而滯留不僅與肺癌細(xì)胞的大小有關(guān)，更多的原因是肺癌細(xì)胞表面分子“認(rèn)識”腦血管床內(nèi)皮細(xì)胞［5］，這種所謂的“認(rèn)識”可能是導(dǎo)致肺癌腦轉(zhuǎn)移易發(fā)生的原因之一。

在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，血管的生成是一個不可缺少的環(huán)節(jié)，它不僅為腫瘤細(xì)胞提供血供，而且也是其轉(zhuǎn)移的重要途徑。上世紀(jì)70年代初Folkman首先提出了“腫瘤生長依賴血管的形成”的概念，自此，新生血管與腫瘤的關(guān)系引起了廣大學(xué)者的高度重視，越來越多研究者致力于腫瘤與新生血管關(guān)系的研究［6］。體積大于l～2mm腫瘤的生長需要新生血管提供氧分和營養(yǎng)，清除代謝產(chǎn)物，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要血管的支持［7］。作者認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中，沒有血管或淋巴管等結(jié)構(gòu)提供營養(yǎng)支持其生存。因此，腫瘤細(xì)胞應(yīng)自身具備形成脈管化的分子生物學(xué)功能和特性，不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移還能維持自我生長需要。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到目的部位后，才能逐漸分化成各種管腔結(jié)構(gòu)即腫瘤細(xì)胞的血管生成擬態(tài)，方便為其提供養(yǎng)分及進(jìn)一步轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞具備不同屬性即腫瘤細(xì)胞具備異質(zhì)性，在生長和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為過程中承擔(dān)不同角色。部分腫瘤細(xì)胞具備向血管或淋巴管等管腔內(nèi)皮分化以形成脈管結(jié)構(gòu)的能力，不但增加了與血管的親和力進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移而且具有為其他細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的養(yǎng)分和途徑，以達(dá)到在轉(zhuǎn)移灶繼續(xù)生長的目的。為了證實該假設(shè)，我們利用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法評估了幾種特異性和敏感性較好的內(nèi)皮標(biāo)記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ等在腦脊液轉(zhuǎn)移腺性癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮標(biāo)記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ等在轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞中表達(dá)率均超過50%，其中FⅧ的表達(dá)最為明顯。而在原發(fā)腺癌組織中均無表達(dá)，說明轉(zhuǎn)移腺癌細(xì)胞具有向內(nèi)皮分化的傾向，具有內(nèi)皮細(xì)胞的分子生物學(xué)特性。

CD34、CD105等為 MVD的常用標(biāo)記物。CD34因在大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞上呈陽性表達(dá)而被定名為泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，與FⅧ一起用于檢測腫瘤新生血管微血管密度，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。CD105是一種同型二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，分子質(zhì)量為180KD，是轉(zhuǎn)化生長因子TGF－β的配體，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞對TGF－β的反應(yīng)，促進(jìn)血管生成，參與腫瘤分化、生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［9］。其中，CD34對內(nèi)皮細(xì)胞更敏感，而CD105在新生毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞即增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)率更高，是目前衡量內(nèi)皮增殖狀態(tài)較準(zhǔn)確的指標(biāo)［10］。

D2－40是一種相對特異的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，僅在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)呈陰性反應(yīng)，是敏感性和特異性均較高的淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物。D2－40在淋巴管瘤中呈陽性表達(dá)，而在良性的血管腫瘤中呈陰性表達(dá)。雖然有報道D2－40在鱗狀上皮的基底細(xì)胞有陽性表達(dá)，但卻不表達(dá)于血管內(nèi)皮。所以具有高度特異性、敏感性的淋巴管標(biāo)記物D2－40可以廣泛用于腫瘤新生淋巴管的研究。已有學(xué)者用其分析乳腺癌及黑色素瘤中的微淋巴密度，認(rèn)為D2－40的敏感性和特異性是現(xiàn)有淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物中最好的［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，D2－40在腦脊液中的轉(zhuǎn)移腺癌中陽性表達(dá)，說明轉(zhuǎn)移腺癌細(xì)胞能夠分泌新生淋巴管的相關(guān)蛋白，具有向腫瘤淋巴管分化的潛能。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），早期亦稱作血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子（heparin－binding growth factor），可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生（induce angiogenesis in vivo）。VEGF的陽性表達(dá)，有力地證明了腦脊液中腺癌細(xì)胞具備血管內(nèi)皮的分子生物學(xué)活性。有研究表明，VEGF家族的一些成員不僅可以促進(jìn)血管生成同樣可以促進(jìn)淋巴管的發(fā)生。這些新生成的血管和淋巴管比正常脈管更適宜于腫瘤的侵襲［12］。VEGF的表達(dá)可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對腦的親和性，可使腫瘤細(xì)胞易于通過腦組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)而促成腦轉(zhuǎn)移［13］。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠誘導(dǎo)上皮、間質(zhì)及神經(jīng)源性細(xì)胞廣泛增殖和分化，且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移關(guān)系密相關(guān)［14－17］。b－FGF 具有較強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增加內(nèi)皮細(xì)胞的化學(xué)趨向性等作用。此外，vimentin陽性表達(dá)說明腫瘤細(xì)胞具備向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)了侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。

通過對99例腦脊液中腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，CD34、CD105等血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物及淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2－40和成纖維生長因子均有表達(dá)，且與炎性腦脊液中的炎性細(xì)胞相比其陽性率具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果從一定程度證明了作者的假設(shè)，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)移的肺腺癌腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)不同的血管生長因子，從而具備內(nèi)皮細(xì)胞的特性，一方面有助于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞通過血道轉(zhuǎn)移的能力，具有形成脈管結(jié)構(gòu)的潛能，而并不需要建立血管的支持。另一方面彌補(bǔ)了血管供血不足的缺點，致使在缺氧的條件下仍然能夠生長，增強(qiáng)自我生存的能力。

近年來在腫瘤領(lǐng)域研究的重大進(jìn)展之一就是確立了腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)展中的重要地位與抗血管生成治療腫瘤的意義，腫瘤生成依賴血管形成，腫瘤的生長、局部浸潤及轉(zhuǎn)移必須以適宜的血液供應(yīng)為前提。因此，腫瘤細(xì)胞的多種血管和淋巴管標(biāo)記物的表達(dá)對于進(jìn)一步研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有著十分重要的意義。

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