趙柳蘭 楊筱珍 成永旭* 楊 淞

（1上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海市高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)E－研究院，上海201306；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，雅安625014）

肥大細(xì)胞是體內(nèi)組織胺的主要來源，主要分布在血管相鄰的結(jié)締組織、淋巴細(xì)胞、呼吸和胃腸道系統(tǒng)，以及皮膚［1］。已有研究表明肥大細(xì)胞與哺乳動物體內(nèi)最常見的功能性胃腸疾病密切相關(guān)［2］，肥大細(xì)胞在潰瘍腸道組出現(xiàn)明顯脫顆?，F(xiàn)象［3］，而飼料中加入不同的添加劑（幼康寶和丁酸鈉）能夠不同程度地促進(jìn)肉雞小腸肥大細(xì)胞的數(shù)量增加［4］，因此肥大細(xì)胞的分布規(guī)律為腸道的病理機(jī)制提供了重要的依據(jù)。目前已有研究證實在多種動物體內(nèi)存在肥大細(xì)胞，如魚類，家禽，兩棲以及哺乳動物等［5－10］。甲殼動物中肥大細(xì)胞的研究基本未見報道。而顯示肥大細(xì)胞的染色方法較多，其中低p H值的甲苯胺藍(lán)染色法和阿利新藍(lán)染色法是研究動物肥大細(xì)胞2種最典型的方法［5－10］。因此本研究用這兩種染色方法，探究中華絨螯蟹肥大細(xì)胞的形態(tài)和分布特點。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）隸屬于十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、絨螯蟹屬（Eriocheir），俗稱河蟹、大閘蟹，因其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，廣受大眾喜愛而具有較高的經(jīng)濟(jì)價值［11］，而在中華絨螯蟹養(yǎng)殖的過程中，魚粉和冰鮮野雜魚常常被作為飼料原料或直接投喂，飼料或者野雜魚的變質(zhì)、腐敗，會產(chǎn)生大量的生物胺。而組織胺作最毒（scombroid poisoning）的一種生物胺，常被作為檢測魚粉生產(chǎn)質(zhì)量以及野雜魚的新鮮度的一個標(biāo)準(zhǔn)［12－13］，同時組織胺能夠造成魚或蝦胃腸道發(fā)育不良和功能障礙，甚至死亡等［14，15］。而有關(guān)組織胺對水產(chǎn)動物影響的研究起步較遲，其作用機(jī)理卻鮮見報道。因此中華絨螯蟹肥大細(xì)胞的研究為揭示內(nèi)外源組織胺作用水產(chǎn)動物機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.材料

1.1 材料 健康中華絨螯蟹5只（125g），取中腸，腸球，后腸，中華絨螯蟹的消化道的觀察分成中腸和后腸，而腸球是位于中腸和后腸之間的膨大部分［16］，用Carnoy氏液（V無水乙醇∶V氯仿∶V冰醋酸＝6∶3∶1）4℃固定2 h，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，進(jìn)行染色，觀察，Leica DM2500顯微鏡（Image－Pro Express 6.0軟件）拍照。

1.2 主要試劑

甲苯胺藍(lán)，鹽酸，酒精，阿爾新藍(lán)8GX，藏花紅O，均購自上海國藥。

2.組織化學(xué)方法

2.1 常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，下行至蒸餾水，入蘇木素伊紅染液染30 min，1%鹽酸酒精分色，100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.2 甲苯胺藍(lán)染色（TB）［6］石蠟切片常規(guī)脫蠟，下行至蒸餾水；入甲苯胺藍(lán)高錳酸鉀染液（將7.5 g／L甲苯胺藍(lán)溶液煮沸10 min后，逐滴入22.5 g／L高錳酸鉀溶液，10 min后蒸餾水定容至100 ml，過濾備用）中染色30 s，蒸餾水洗2次×5 min，用90%酒精分色（顯微鏡下控制），100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。肥大細(xì)胞呈藍(lán)色。

2.3 阿爾新蘭－藏紅染色（AB／SO）［6］用p H＝1.42醋酸鈉－鹽酸緩沖液配置0.36%阿爾新藍(lán)8GX和0.018%藏花紅O混合染液；石蠟切片常規(guī)脫蠟，脫水至蒸餾水，將切片入上述混合染液中30 min，蒸餾水洗兩次2次×5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。肥大細(xì)胞有的胞漿呈藍(lán)色，有的呈紅色。

結(jié) 果

1.不同染色方法對腸道肥大細(xì)胞染色效果

采用TB和AB／SO兩種染色 均能不同程度的陽性顯示中華絨螯蟹腸道的肥大細(xì)胞，腸道上皮細(xì)胞肥大細(xì)胞的形態(tài)主要為橢圓形或者圓形（圖1E’），具體的著色程度如下表1。TB染色較AB／SO陽性細(xì)胞較強(qiáng)烈，且細(xì)胞輪廓更為清晰。

表1 不同染色方法對中華絨螯蟹腸道的肥大細(xì)胞染色效果Table 1 the staining effects of mast cell in the intestinal tract of E.sinensis by TB and AB／SO staining

2.不同染色部位肥大細(xì)胞的分布規(guī)律

腸球 主要由致密嗜堿性顆粒和其腸球的邊緣

少數(shù)大的嗜酸性顆粒和嗜堿性顆粒組成（圖1A）。TB和AB／SO兩種染色腸球均有陽性細(xì)胞，且分布基本一致（圖1B和C），主要分布在腸球邊緣少數(shù)存在的嗜酸性顆粒和嗜堿性顆粒中，其中AB／SO染色出現(xiàn)紅色大顆粒（圖1C→示）和藍(lán)色小顆粒（圖1C?示）兩種異質(zhì)性的肥大細(xì)胞。

中腸 是分為中腸前段（圖1D），中腸中段（圖1 E）和中腸后段（圖1F）。中腸前段主要由粘膜層，粘膜下層，肌層，外膜組成，其中粘膜層由粘膜上皮和基膜組成，基膜明顯，粘膜下層不明顯；外膜由細(xì)胞層和薄層的疏松結(jié)締組織構(gòu)成（圖1D）中腸中段的粘膜上皮和基膜向腔內(nèi)折疊形成凸起（圖1G，H，I），外膜的結(jié)締組織中存在嗜堿性的藍(lán)色顆粒（圖1G→示）和嗜酸性的紅色顆粒（圖1G?示）中腸后段凸起增高增多（圖1J，K，L）；

中腸經(jīng)過TB和AB／SO染色，均發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在中腸的前段主要分布在粘膜上皮的上皮細(xì)胞（圖1E，F(xiàn)），TB染色的粘膜層上皮細(xì)胞中胞漿著染藍(lán)色（圖1E’）；中腸中段和后段肥大細(xì)胞主要分布在基膜（圖1H）及外膜結(jié)締組織中（圖1H，I，K，L），且TB染色基膜、外膜的結(jié)締組織的顆粒（圖1E、H）以及不連續(xù)的細(xì)胞層（圖1K）的陽性均呈藍(lán)色，細(xì)胞大小不一，形狀各異（圖1H）；而AB／SO染色外膜結(jié)締組織中的細(xì)胞著染的顏色存在異質(zhì)性：有的為紅色（圖1I，L?示），有的為藍(lán)色（圖1I，L→示）。其中紅色顆粒大而少，藍(lán)色顆粒小而多。

圖1 腸球和中腸的肥大細(xì)胞染色A，D，G，J為蘇木精－伊紅染色（HE染色）；B，E，E’，H，K為甲苯胺藍(lán)染色（TB染色）；C，F(xiàn)，I為阿爾新蘭－藏紅染色（AB／SO染色）；其中A，B，C為腸球，D－F為中腸前段，G－I為中腸中段，J－L為中腸后段D，E，F(xiàn)，K：→示粘膜上皮細(xì)胞；?示外膜的結(jié)締組織中的顆粒；G：HE染色 →深藍(lán)色嗜堿性顆粒，?為紅色嗜酸性顆粒物質(zhì)H：→示基膜，?示外膜的結(jié)締組織中的顆粒；I：AB／SO染色，→藍(lán)色顆粒，?紅色顆粒K：TB染色，→示上皮細(xì)胞，?示外膜的不連續(xù)細(xì)胞層Fig.1 The distribution of mast cells in theintestinal bulb and midgutA，D，G，J staining with hematoxylin and eosin（HE）；B，E，E’，H，K staining with Toluidine Blue（TB）C，F(xiàn)，I staining with Alcian Blue－Safranin O（AB／SO）；A，B，C intestinal bulb，D～F midgut anterior segment，G～I(xiàn) midgut intermediate segment，J～L midgut posterior segment；D，E，F(xiàn)，K：→showed the mucous layer of epithelial cells；?showed granule in the outer membrane of connective tissue G：HE staining→showed acidophilic，?showed basophilic granulocytes；H：→showed basilemma，?showed granule in the outer membrane of connective tissue；I：AB／SO staining→blue granules，?red granules；K：TB staining，→showed epithelial cells，?showed discrete cell layer in the outer membrane

圖2 后腸的肥大細(xì)胞染色A，D，G為 HE染色；B，E，H，J為TB染色；C，F(xiàn)，I，K，L為 AB／SO染色；A，B，C：→示粘膜下層的結(jié)締組織顆粒 D，E，F(xiàn)：→示固有層顆粒，?示粘膜層的上皮細(xì)胞 G，H，I，J，K：→示腸腺，?示上皮細(xì)胞L：→ 示肌層，?示粘膜層表面膜Fig.2 the distribution of mast cells in thehindgutA，D，G staining with HE；B，E，H，J staining with TB；C，F(xiàn)，I，K，L staining with AB／SOA，B，C：→granules in the submucosa of connective tissue；D，E，F(xiàn)：→granules in the lamina propria；?showed the mucous layer of epithelial cells；→G，H，I，J，K：→hindgut gland；?epithelial cells；L→muscular layer，?surface of mucous layer

后腸，皺襞少而大，形成嵴，外膜發(fā)達(dá)（圖2AF）；后段皺襞小而多，其粘膜下層的結(jié)締組織中含有非常發(fā)達(dá)的腸腺（圖2G－L）；經(jīng)過TB和AB／SO染色發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞主要分布在后腸粘膜層上皮細(xì)胞，粘膜下層的結(jié)締組織顆粒及腸腺（圖2B，C，E，F(xiàn)，H，I，K，L）。TB染色后，粘膜層上皮細(xì)胞，藍(lán)色呈零星分布（圖2E，H，J?示），而固有層也偶有淡染細(xì)胞（圖2E→示）；其后腸腺花瓣狀細(xì)胞外緣細(xì)胞著染藍(lán)色（圖2 H，J→示）；后腸的粘膜層表面深藍(lán)色（圖2B，J）；AB／SO染色的粘膜下層顆粒呈紅色（圖2B→示），粘膜層的上皮細(xì)胞也偶爾有細(xì)胞著染藍(lán)色（圖2I，K?示），固有層偶有著染（圖2F→示）；其整個腸腺的深染（圖2I，K→示）；粘膜層表面出現(xiàn)深藍(lán)色（圖2F，I，K，L?示）；其肌肉層中，出現(xiàn)一層紅色的細(xì)胞（圖2L：→示）。

討 論

肥大細(xì)胞是體內(nèi)組織胺的主要來源，是一群獨特的細(xì)胞，起源于骨髓細(xì)胞，其主要分布在血管相鄰的結(jié)締組織、淋巴組織、呼吸和胃腸道系統(tǒng)，以及皮膚［1］。目前已有研究證實在多種動物體內(nèi)存在肥大細(xì)胞，如魚類，家禽，兩棲以及哺乳動物等等［5－10］。甲殼動物中肥大細(xì)胞的研究基本未見報道。而顯示肥大細(xì)胞的染色方法較多，其中低p H值的甲苯胺藍(lán)染色法和阿利新藍(lán)染色法是研究動物肥大細(xì)胞2種最典型的方法［5－10］。而本研究發(fā)現(xiàn)用這兩種染色方法，均發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹腸球、后腸以及嵴均發(fā)現(xiàn)有特異性的細(xì)胞著染，說明中華絨螯蟹腸道中存在肥大細(xì)胞。用TB著染的細(xì)胞陽性較為強(qiáng)烈，且細(xì)胞輪廓比較清晰，形態(tài)多為圓形或橢圓形，而AB／SO著染的細(xì)胞顏色較淺，輪廓不清晰，細(xì)胞形態(tài)不一，說明肥大細(xì)胞的染色效果與染色方法相關(guān)［9，17］，且本研究表明TB更為適合對中華絨螯蟹的腸道進(jìn)行著染。

而對于消化道肥大細(xì)胞的分布規(guī)律，有許多學(xué)者研究不一。本研究發(fā)現(xiàn)在中腸粘膜層的上皮細(xì)胞，基膜以及外膜的結(jié)締組織顆粒著染，并且在后腸的粘膜下層的結(jié)締組織顆粒，粘膜層的上皮細(xì)胞和腸腺中也存在肥大細(xì)胞。日本鰻鱺腸道，蟾蜍和腸道的肥大細(xì)胞的分布與本研究類似［7，8］；而 Reite發(fā)現(xiàn)白斑狗魚腸道中肥大細(xì)胞在消化道中的分布更為廣泛，不僅在致密層和固有層中有分布，從固有層到粘膜層的結(jié)締組織中，以及腸道的環(huán)肌和縱肌層，甚至相連的腸系膜組織和上皮細(xì)胞中也存在［5］；且其結(jié)締組織中顆粒有異質(zhì)性染色的肥大細(xì)胞，并且該顆粒物質(zhì)為嗜伊紅的顆粒細(xì)胞，本研究在中腸中也發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性的著染的肥大細(xì)胞（圖版1I，L），這可能與肥大細(xì)胞的類型相關(guān)，肥大細(xì)胞分為粘膜型和結(jié)締組織型的，其功能分別為參與宿主的免疫反應(yīng)和參與血管生成和組織代謝［18］。對于粘膜下層結(jié)締組織中的肥大細(xì)胞顆粒物質(zhì)，與姜永華報道的胃以及腸道中存在的乳糜顆粒物質(zhì)形態(tài)類似，并且該研究者發(fā)現(xiàn)這些顆粒汞溴酚藍(lán)深染，并呈PAS強(qiáng)陽性［19］，說明其含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，而肥大細(xì)胞中組織胺的釋放能夠改善局部血液循環(huán)和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)［20］，這為內(nèi)外源組織胺作用水產(chǎn)動物機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

目前對于中華絨螯蟹腸球的具體結(jié)構(gòu)和功能的研究基本未見，本實驗通過HE染色發(fā)現(xiàn)存在嗜堿性顆粒肥大細(xì)胞特異性著染。有學(xué)者猜測因其結(jié)構(gòu)處于中腸和后腸過渡結(jié)構(gòu)，可能兼具中腸和后腸的一些功能，即中腸的分泌與后腸的收縮重吸收［16］。而本課題組證實在腸球中存在組織胺免疫組化陽性，并且其分布與肥大細(xì)胞的著染細(xì)胞一致，暗示這些肥大細(xì)胞可能就是這些組織胺陽性的來源，與肥大細(xì)胞中存在組織胺的說法一致［1］。本研究AB／SO染色發(fā)現(xiàn)肌肉層中存在紅色細(xì)胞，這可能支持腸道肥大細(xì)胞與消化道平滑肌的收縮有關(guān)。組織胺引起的這種收縮是否與肥大細(xì)胞釋放的組織胺有關(guān)呢？至于腸球究竟是否存在分泌功能，甲殼動物肥大細(xì)胞究竟與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其他動物的肥大細(xì)胞是同一類細(xì)胞，這些都不得而知，因此這些研究有待進(jìn)一步的探究。

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