陳武兵 金巧智 孫棟勛 蔡志毅

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，主要發(fā)生在我國南方地區(qū)，近年來其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。目前臨床主要以高劑量的放療聯(lián)合化療治療為主，但對于中晚期患者，預(yù)后仍不夠理想且不良反應(yīng)大，患者往往難以忍受，且易產(chǎn)生耐藥性［1～4］，因此迫切需要研究和開發(fā)高效低毒的新藥。紫草素即是從中藥紫草科植物紫草的根中提取的一種低分子萘醌類化合物，具有較廣的生物藥理學活性，大量醫(yī)學實驗研究表明，其可在多個層面上抑制多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［5］。

紫草素在對人宮頸癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞、惡性黑色素瘤等多種腫瘤細胞增殖與凋亡方面的研究已有相關(guān)文獻報道［6～9］。但是紫草素對于人鼻咽癌作用的相關(guān)國內(nèi)外研究報道甚少，所以本研究旨在探究紫草素對人鼻咽癌CNE－1細胞增殖、凋亡、細胞周期、細胞遷移能力等生物學行為的影響，以期為進一步研究紫草素抑制鼻咽癌細胞生長與侵襲的作用機制提供基礎(chǔ)研究依據(jù)，初步探索紫草素治療鼻咽癌的可能性。

材料與方法

1．實驗材料:人高分化鼻咽癌細胞株CNE－1購于中國科學院上海細胞庫;紫草素購于Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗均為Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶－EDTA消化液、細胞凍存液、PBS緩沖液、Hoechst33258染色試劑盒、Annexin V－FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司;MTT試劑盒、抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司。

2．細胞培養(yǎng):CNE－1接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中(pH7．2)，在37℃、含5%CO2濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24～48h換培養(yǎng)液，經(jīng)3次傳代穩(wěn)定后取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

3．紫草素培養(yǎng)液配制及實驗分組:將粉末狀進口紫草素先以1mg/ml的濃度溶于新鮮配制的培養(yǎng)液中形成母液，然后依次稀釋配制成1、5、10、15 μg/ml濃度的工作液，抽濾滅菌，4℃避光保存。實驗分為無藥物處理組(對照組)和藥物處理組(實驗組)。以下各實驗所應(yīng)用的藥物濃度及作用時間均為預(yù)實驗篩選所得到的最佳作用濃度與作用時間。

4．利用細胞生長曲線繪制法及MTT法，分別進行細胞增殖分析。(1)細胞生長曲線法:將對數(shù)生長期的CNE－1細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種3×104細胞于0．5ml RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第2天開始，換液后分別在細胞中加入含不同濃度紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培養(yǎng)基 0.5ml，對照組使用不含紫草素的培養(yǎng)基，從第3天起，對照組和各實驗組每天收集4個復(fù)孔的細胞用guava easyCyte 8HT流式細胞儀分別進行計數(shù)，共計數(shù)4天(第3天設(shè)定為d1，第4天為d2，第5天為d3，第6天為d4)，實驗獨立重復(fù)3次。然后以作用時間作為橫坐標(即d0～d4)，以對應(yīng)每天的細胞數(shù)平均值作為縱坐標，繪制細胞生長曲線圖。(2)MTT法:取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板中(1×104個/毫升)，每孔100μl，常規(guī)培養(yǎng)12h，換液后分別加入含不同濃度的紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培養(yǎng)基 100μl，對照組培養(yǎng)基不含紫草素，繼續(xù)孵育48h，隨后每孔細胞加入10μl MTT試劑，作用4h后加入100μl formanzen溶解液，繼續(xù)作用4h后用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定光吸收值(D)。每組設(shè)置4個復(fù)孔。以對照組細胞的平均D值為100%活細胞數(shù)目，其他各實驗組細胞的平均D值分別與對照組細胞的平均D值相除，求出各實驗組細胞的相對活細胞數(shù)目。最后，以相對活細胞數(shù)目為縱坐標、以不同濃度紫草素為橫坐標進行制圖。

5．熒光顯微鏡觀察細胞凋亡:將對數(shù)生長期細胞以2×105個/毫升接種于放有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12h后換液加入含紫草素終濃度為5、10μg/ml的培養(yǎng)基1ml，作用48h后，參照南京凱基生物的細胞凋亡熒光Hochest33258試劑盒說明書進行操作，在熒光顯微鏡下觀察、攝像。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。

6．流式細胞儀檢測細胞周期變化:取對數(shù)生長期細胞，每孔5×105個細胞接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，實驗組加入紫草素1、5、10μg/ml，對照組不加藥物。分別培養(yǎng) 48h，收集培養(yǎng)細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，70%乙醇(4℃預(yù)冷)固定細胞過夜，離心棄乙醇后用預(yù)冷的PBS洗滌2次，倒掉上清，每管加入PI染液，4℃染色30min后400目篩網(wǎng)過濾上機檢測，在流式細胞儀上用激發(fā)波長EX=488nm，發(fā)射波長EM=530nm測定各組細胞DNA含量的變化，利用計算機細胞周期分析軟件計算出各時相分布的百分比(%)，實驗重復(fù)進行4次。以增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示細胞的增殖活性，PI公式如下:

7．劃痕擦傷遷移實驗檢測紫草素對CNE－1細胞遷移能力的影響:在6孔板背面畫直線做標記，取對數(shù)生長期的CNE－1細胞(5×105個/毫升)接種于做了標記的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合達80% ～90%左右時，棄去培養(yǎng)基，PBS輕洗細胞2次后，用100μl移液器槍頭在培養(yǎng)孔的中央沿縱軸方向劃以直線(長50mm，寬1．2mm)。用無菌PBS液輕洗細胞2次，以去除已被刮除的漂浮細胞。再向每孔中加入不同濃度紫草素(1、5、10、15μg/ml)，對照組常規(guī)培養(yǎng)，分別于 24、48h時于倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的生長狀況并拍照。每組檢測5個視野，每組4個復(fù)孔，計算遷移率=(1－實驗組/對照組)×100%。

8．統(tǒng)計學方法:采用SPSS 17軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用配對t檢驗;多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．紫草素抑制鼻咽癌細胞株CNE－1細胞增殖:流式細胞儀計數(shù)繪制細胞生長曲線見圖1，結(jié)果顯示，從第1天起，各濃度紫草素處理后CNE－1細胞生長開始變慢。從第2天開始，各實驗組細胞生長速度明顯變慢，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，且隨著濃度與時間的增加，其生長抑制程度也逐漸加重。MTT 法測定結(jié)果如圖 2，1、5、10、15μg/ml紫草素分別處理CNE－1細胞48h后，CNE－1細胞的相對活細胞數(shù)目明顯減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05或P＜0．01)，且與紫草素濃度呈遞降關(guān)系。

圖1 紫草素處理CNE－1細胞后對細胞生長的影響

圖2 MTT法檢測各濃度紫草素處理CNE－1細胞48h后的細胞增殖變化

2．紫草素處理后的細胞凋亡形態(tài)學觀察:如圖3所示，經(jīng)Hoechst33258染色的CNE－1細胞對照組呈淡藍色熒光，細胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。實驗組出現(xiàn)較多的凋亡細胞，表現(xiàn)為亮藍色的核固縮和核碎裂呈分葉狀，其染色質(zhì)分布不均勻，部分細胞核縮小，染色質(zhì)凝聚，呈顆粒團狀分布，有的核碎裂形成多個球形顆粒。

圖3 紫草素(1、5、10μg/ml)作用細胞24h后的Hoechst染色結(jié)果(×400)

3．紫草素對鼻咽癌細胞周期的影響:經(jīng)不同濃度紫草素處理后，CNE－1的細胞周期分布發(fā)生了明顯的變化(表1)。結(jié)果顯示，實驗組(1、5、10μg/ml)的增殖指數(shù)分別為 56．32%、45．77%、35．04%，其中 5、10μg/ml組分別與對照組的58．64%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。同時這兩個實驗組的G0/G1期比例升高，S期比例降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，并且隨著藥物濃度增大，G0/G1期細胞的比例隨濃度依賴性增大。而1μg/ml實驗組與對照組比較細胞周期分布無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)。細胞周期變化(%，x ± s，n=4)

表1 不同濃度紫草素作用CNE－1細胞48h的

4．CNE－1細胞的劃痕擦傷遷移實驗:如表2所示，培養(yǎng)細胞24h和48h后，CNE－1細胞發(fā)生遷移，對照組分別遷移了1．7、2．3μm，而加入不同濃度紫草素后，細胞的遷移能力較對照組明顯減弱，當用15μg/ml紫草素作用CNE－1細胞24h時，細胞遷移率為23.5%，即紫草素對CNE－1細胞遷移抑制率達76．5%。

表2 不同濃度紫草素作用CNE－1后細胞遷移的距離變化

討 論

從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的中藥活性成分，是近年來抗腫瘤藥物研究熱點之一［10］。紫草素是中藥紫草的有效成分之一，體外研究發(fā)現(xiàn)紫草素能抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡。

抑制腫瘤細胞的增殖、誘導凋亡是不同作用機制的抗癌藥物發(fā)揮療效的共同途徑。本研究結(jié)果顯示，CNE－1細胞是一株分裂增殖旺盛的細胞。但經(jīng)不同濃度紫草素處理后，通過繪制細胞生長曲線及MTT法檢測細胞相對存活率，顯示各濃度組紫草素對CNE－1細胞的抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05或P＜0．01)，提示紫草素在一定濃度范圍內(nèi)能顯著抑制CNE－1細胞生長，并呈濃度與時間依賴性趨勢。

細胞凋亡是機體的一種細胞程序性死亡，與腫瘤的生長及發(fā)展密切相關(guān)，凋亡的抑制是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［1，11，12］。多數(shù)的抗腫瘤藥物都是通過激活凋亡通路引發(fā)細胞凋亡而達到治療效果的［13，14］?？疾旌丸b定 CNE －1細胞經(jīng)紫草素誘導處理前后的細胞形態(tài)變化，是判斷細胞是否凋亡的一個重要指標。本研究通過Hoechst33258染色在熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，1、5、10μg/ml實驗組中可看到較多的典型凋亡細胞特征:明顯的核仁減少、染色深、染色體濃縮、邊集，核裂碎，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀，并有凋亡小體形成。以上特征說明紫草素具有誘導人鼻咽癌CNE－1細胞凋亡的生物學效應(yīng)。

細胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和分裂期(M期)，其失控可造成細胞惡性增殖［15］。其中G1期的長短在很大程度上決定了細胞周期的長短，即細胞增殖的速度。紫草素能否通過影響細胞周期的分布從而抑制CNE－1細胞增殖是本研究內(nèi)容之一。本研究表明5、10μg/ml紫草素實驗組細胞周期分布發(fā)生了明顯的變化，隨著濃度的升高，G0/G1期比例逐漸升高，S期比例逐漸降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，細胞周期被阻滯于G0/G1期。同時5、10μg/ml組的增殖指數(shù)分別為45．77%、35．04%，與對照組的 58．64%相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。提示紫草素可通過阻滯CNE－1細胞周期于G0/G1期來抑制細胞增殖分裂。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要惡性標志，只有進一步阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生才更有意義。結(jié)果顯示實驗組劃痕處的空白未見明顯縮小，而對照組劃痕兩側(cè)的細胞已基本覆蓋了劃痕處的空白，且紫草素作用后CNE－1細胞遷移率明顯下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，表明紫草素能明顯抑制CNE－1細胞遷移。研究結(jié)果顯示，紫草素能體外抑制人鼻咽癌CNE－1細胞的生長、阻滯CNE－1細胞周期于G0/G1期、誘導細胞凋亡并抑制細胞遷移能力，使得紫草素有可能成為治療鼻咽癌的一種新型抗腫瘤候選中藥，同時也為鼻咽癌的臨床防治工作提供了重要的基礎(chǔ)實驗研究依據(jù)。

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