何紫琪 李從榮 楊艷兵 吳 青 余 華

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)因其發(fā)病率高、傳染性強、傳播面廣，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO報道，全世界大約有20億人曾經(jīng)感染過HBV，超過2．4億的患者發(fā)展為慢性化，每年約有60萬人因急、慢性HBV感染而死亡［1］。乙型肝炎患者主要集聚在亞洲，該地區(qū)大多數(shù)人在兒童時期就感染HBV，8% ～10%的成人發(fā)展為慢性感染者，在中國更為嚴重［1］。HBV主要通過血液傳播，因此要對獻血員進行嚴格的HBsAg篩查，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會(原衛(wèi)生部)出臺的《獻血者健康檢查要求》規(guī)定:獻血者要進行HBsAg的檢測。HBsAg是HBV感染最早出現(xiàn)的免疫學標志物，HBsAg檢測可以縮短病原檢出的“窗口期”，也能避免感染恢復后假陽性結果的產(chǎn)生，是病原體診斷的趨勢所在。本研究擬利用量子點與磁微粒的特性，建立一種便捷、高靈敏度的HBsAg的檢測方法。

材料與方法

1．試劑和儀器:發(fā)射波長為605nm的鏈霉親和素化CdSe/Zns硒化鎘量子點(武漢珈源量子點公司)、粒徑3 μm的xMagTM異硫氰酸根末端磁微粒(陜西北美基因股份有限公司)、HBsAg adr protein、生物素化兔抗 HBsAg－IgG、鼠抗 HB-sAg－IgG(英國Abcam公司)。DDHZ－300型恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)、磁選分離器(西北美基因股份有限公司)、EURO StarⅡ型熒光顯微鏡(德國EURO公司)、BIORAD680型酶標儀(美國BIO RAD公司)。

2．方法:(1)磁微粒(MMS)與抗體偶聯(lián):嚴格按照說明書進行MMS的活化、抗體偶聯(lián)、清洗和封閉，分別以不同濃度的鼠抗 HBsAg－IgG 與 MMS偶聯(lián)，以(OD原始抗體－OD清洗液)/OD原始抗體計算連接效率，并選擇最合適的抗體濃度。(2)量子點(QD)與抗體連接方法學的建立:用pH值7．2的PBS緩沖液以1∶500稀釋鏈霉親和素化的量子點，4℃保存?zhèn)溆?。用不同濃度生物素化兔抗HBsAg－IgG連接QD，37℃振蕩反應15min;將QD－單抗復合物進行高速離心，取上清液行蛋白含量檢測，以(OD原始抗體－OD清洗液)/OD原始抗體計算連接效率，并選擇最適抗體濃度。(3)HBsAg檢測體系的建立:取5μl MMS－單抗復合物與100μl QD－多抗復合物置于1．5ml EP管內(nèi)，加入不同濃度的HBsAg，用正常人血清作為陰性對照，37℃振蕩反應，分別于5、10、20、30、40、60、120min 時間點進行磁分離并洗滌，重懸至100μl。取20 μl于熒光顯微鏡下檢測熒光。(4)臨床應用評價:隨機抽取筆者醫(yī)院HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗體陽性患者的血清，以及脂血、溶血、黃疸標本，用上述方法檢測，觀察有無交叉反應。隨機抽取筆者醫(yī)院HBV DNA陽性、陰性患者血清標本各60例(經(jīng)qPCR定量)，用上述方法檢測，并與qPCR、ELISA法比較，評價其HBsAg的檢測效率。

3．統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17．0軟件，不同方法檢測率的比較采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．MMS、QD偶聯(lián)抗體最佳濃度:MMS偶聯(lián)鼠抗HBsAg－IgG的效率在其濃度≤50μg/ml時，維持在43% ～56%，當抗體濃度超過50μg/ml時，MMS偶聯(lián)效率降低，故以50μg/ml作為偶聯(lián)磁微粒的抗體最佳濃度。QD偶聯(lián)生物素化兔抗HBsAg－IgG的效率在其濃度≤25μg/ml時，維持在37% ～49%，當抗體濃度超過25μg/ml時，QD偶聯(lián)效率降低，故以25μg/ml作為偶聯(lián)量子點的抗體最佳濃度。

2．HBsAg檢測體系:觀察免疫反應時間對檢測結果的影響發(fā)現(xiàn)，30min后可觀察到穩(wěn)定的熒光。當HBsAg濃度為1ng/ml時，可以檢測到熒光。當濃度≥30ng/ml時，鏡下觀察熒光趨于穩(wěn)定，認為抗體已完全消耗。熒光顯微鏡下的觀察結果見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下量子點磁微?？乖瓘秃衔?/p>

3．臨床應用評價:HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗體陽性患者的血清標中均未發(fā)現(xiàn)熒光，溶血、脂血、黃疸標本中也未檢出熒光。60例HBV DNA陽性患者血清中有4例未檢出熒光，60例陰性患者血清檢有8例檢出熒光，ELISA法檢測結果與本研究方法結果一致(表1)(P＜0．05)。以熒光定量PCR方法作為參照方法，本方法檢測HBsAg的敏感度、特異性分別為 93．3%(56/60)、86．7%(52/60)。

表1 臨床應用評價

討 論

隨著醫(yī)學的發(fā)展，大量患者通過輸血治療緩解病情、挽救性命，然而，輸血相關的感染性/非感染性危害(病毒感染、急性肺損傷、溶血反應和敗血癥)一直困擾著臨床輸血工作［2，3］。因此輸血安全是輸血醫(yī)學的基石，也是當前全社會關注的焦點問題。輸血安全要做到以下4點:①保證獻血者的安全;②杜絕輸血傳播疾病的發(fā)生;③保證輸血操作準確無誤;④減少輸血不良反應的發(fā)生。其中杜絕經(jīng)血液傳播疾病，做好無償獻血的檢測工作，是保證血液質(zhì)量及輸血安全的關鍵。

雖然血液篩查已極大地降低了輸血傳播疾病的風險，但由于“窗口期”的存在，早期感染會出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象，而單純依靠感染恢復后的抗體又可能出現(xiàn)陽性誤判。病毒效價、免疫沉默性感染、病毒變異以及難以最終消除“窗口期”等因素的存在，輸血相關傳染病還是時有發(fā)生［4］?？乖瓩z測能直觀、準確的檢出病原體的感染，HBsAg在輸血后50～60天首先被檢測到，可以縮短病原檢測的“窗口期”。在檢測出HBsAg的前幾周，血清中可檢測到低水平病毒;在血清陽轉前，HBV DNA增長速度慢于 HCV和HIV，HBV感染的窗口期，由于HBV DNA水平相對較低(平均＜1000拷貝/毫升，范圍1～2400拷貝/毫升)，核酸檢測技術僅能檢出小部分假陰性獻血員。雖然核酸檢測技術是一種核酸檢測的重要方法，其敏感度、特異性均較高，但其檢測儀器、技術及成本均高，基層單位不能常規(guī)開展該項目［5］。膠體金檢測技術雖然簡便快捷，但其敏感度低、假陰性率高，而且成本較高，不適宜作為獻血人員HBsAg的初篩方法。

QD具有獨特的光譜特征和光化學穩(wěn)定性，因而受到研究者的重視，目前在醫(yī)學領域主要用于體內(nèi)成像、藥物緩釋、紅外熱療及固相免疫組化分析等［6～8］。MMS具有磁響應性，在磁場中會產(chǎn)生聚集，將其與相應抗原或抗體相連，制作成能捕獲不同目標的免疫磁微粒，在磁場的作用下，便能達到分離結合被檢物量子點的目的［9］。量子點與磁微?？蛇B接多種生物活性基團，如抗體，通過抗原抗體反應即可獲得量子點磁微粒與抗原抗體的復合物，利用磁微粒的可富集特性，經(jīng)過磁場聚集后放大量子點的熒光信號，達到高敏感度檢測目標抗原的目的。合理利用量子點與磁微粒的特性，可以不依賴特殊儀器擴增標本而放大信號，從而在短時間內(nèi)高敏感度檢出目標抗原。

本研究采用抗HBsAg的異源單克隆抗體分別偶聯(lián)QD、MMS，以雙抗體夾心法結合待測標本中的HB-sAg，利用磁微粒在磁場中的富集特性，在液相中聚集大量抗原，提高了檢測的敏感度，本研究方法對HB-sAg的最低檢出濃度為1ng/ml。此外，由于QD的熒光強度高，光化學性質(zhì)穩(wěn)定，熒光淬滅作用小。偶聯(lián)蛋白后的MMS也可冷藏保存，因此，可預先完成QD及MMS的偶聯(lián)標記，然后進行處理標本及檢測目標抗原，大大縮短檢測時間，檢測時間約為40min，較ELISA法可縮短2/3時間。由于本方法是基于量子點熒光信號直接檢測目標抗原，而非檢測吸光度，因而對標本的要求較低，不受脂血、溶血、黃疸等因素影響，具備良好的特異性。

以熒光定量PCR方法為參照方法，本方法檢測HBsAg的敏感度、特異性均較高，而且與ELISA法檢測結果無差異。HBV DNA陽性患者血清中有4例未檢出HBsAg，究其原因可能是機體產(chǎn)生抗體，清除了HBsAg，HBsAg蛋白變性。HBV DNA陰性患者血清檢有8例檢出HBsAg，原因可能有機體產(chǎn)生e抗體，病毒被清除，病毒處于非復制期。本研究建立的方法檢測結果與ELISA一致，但是檢測速度快，與熒光定量PCR技術相比，其成本低，操作簡便，對實驗室及從業(yè)人員要求低，可用于獻血、輸血人員HBsAg的篩查。

磁微粒、量子點標記抗體直接熒光檢測HBsAg操作簡便、無需特殊儀器，敏感度也較高，在流動獻血車及愛心獻血屋的HBsAg人群篩查中有著巨大的潛力和應用前景。

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