張亞敏 徐 虹 孫 華 陳素輝 王富明

缺血性腦血管疾病的高發(fā)生率、高致殘率嚴(yán)重威脅人類生命健康，建立穩(wěn)定性強(qiáng)、可重復(fù)性高的缺血性腦卒中動(dòng)物模型是研究急性腦缺血后腦組織損傷的生理病理變化的基礎(chǔ)。Longa等［1］以改良線栓法制備了大鼠中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，隨后該模型便被廣泛應(yīng)用于腦梗死的研究［2，3］。但MCAO模型制作過程中，易受到多種因素的影響，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的條件不一，導(dǎo)致腦缺血面積的不穩(wěn)定及大鼠高死亡率等問題，無法保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行［4］。本課題組通過固定線栓，控制大鼠體重，以改良的Longa法制作MCAO模型，2h后拔出線栓再灌注，并總結(jié)了特定型號(hào)的栓線適合的大鼠體重范圍。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)用品:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重230～270g，北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012－0001。(2)飼養(yǎng)條件:室溫25 ±1℃，5 只/籠，光照∶黑暗 =12h∶12h，濕度 75%，大鼠術(shù)前自由飲水和攝食。(3)實(shí)驗(yàn)用品:水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5－Triphenyltetrazolium chloride，TTC，Sigma，美國);自制大鼠固定板;尼龍線栓(2636－4A，北京沙東生物技術(shù)有限公司)，大鼠腦槽(中科院藥植所);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP－9160，上海一恒科技有限公司)。

2．分組與模型制作方法:采用數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，組1體重控制為230～249g;組2體重控制為250～269g，每組10只。MCAO模型制作在北京協(xié)和醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作中心完成，參考Longa等［1］的線栓法。術(shù)前大鼠禁食12h，腹腔注射10%的水合氯醛(0．35ml/100g)麻醉后固定。常規(guī)消毒手術(shù)視野區(qū)皮膚，切開頸部正中皮膚約2～3cm，鈍性分離頸部肌肉和結(jié)締組織，從胸鎖乳突肌和頸前肌群之間向深部分離，顯露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。5－0 號(hào)手術(shù)線結(jié)扎ECA根部和CCA分叉處1cm處，CCA掛線但不結(jié)扎，ECA距離CCA分叉處約5mm處剪口，使線栓由小口經(jīng)ECA進(jìn)入CCA，剪斷ECA，線栓進(jìn)入約5mm時(shí)調(diào)整栓線方向和弧度，避開翼腭動(dòng)脈(pterygopalatine artery，PA)的開口處，使栓線沿ICA緩慢插入，遇一定阻力后停止進(jìn)栓，以使線栓完全閉阻右側(cè)大腦中動(dòng)脈入口，線栓插入長度約為18．0±0.5mm。雙線結(jié)扎CCA剪口上方絲線，外留長約1cm左右的線栓后縫合，將大鼠置于籠內(nèi)。腦缺血2h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注前以10%的水合氯醛(0．25ml/100g)腹腔注射麻醉動(dòng)物(減少麻藥用量，防止動(dòng)物因麻藥過量死亡)，緩慢地拉出線栓，當(dāng)看到栓線的黑色標(biāo)記后剪掉栓線。大鼠清醒后自由接觸食物和水。

3．神經(jīng)功能評(píng)分:缺血2h大鼠清醒后參照Bederson等［5］的5級(jí)分類法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行盲評(píng):0級(jí):無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀;1級(jí):提尾，左前肢屈曲，不能完全伸展;2級(jí):提尾，左前肢屈曲，置于地面向左側(cè)推動(dòng)，爬行阻力較右側(cè)下降;3級(jí):在2級(jí)基礎(chǔ)上爬行時(shí)不自主向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4級(jí):意識(shí)不清，包括24h內(nèi)死亡。

4．腦梗死體積測(cè)定:兩組大鼠MCAO術(shù)后24h，腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g)深度麻醉大鼠，快速于冰上斷頭取腦置于平皿中，－20℃速凍10min，待其變硬后取出置于腦槽中，去除額級(jí)，冠狀位切成2mm厚的腦片，取前6塊放入0.1%TTC溶液中避光37℃孵育30min，每5min翻動(dòng)1次使其均勻著色，正常組織染為紅色，腦梗死區(qū)不著色(蒼白色)。4%多聚甲醛固定1h后拍照采圖，Image J軟件分析并計(jì)算梗死體積。為了避免因患側(cè)腦水腫引起的計(jì)算誤差，采用以下公式計(jì)算:右側(cè)梗死面積=左側(cè)腦組織總面積－右側(cè)正常腦組織面積;相對(duì)梗死體積=累積右側(cè)梗死面積/累積正常側(cè)腦組織面積 ×100%［6］。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件包，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組均數(shù)比較和方差齊性檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．兩組大鼠存活情況比較:腦缺血術(shù)后24h觀察兩組大鼠的一般情況，從表1中可以看出組1和組2的死亡率均為10%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩只死亡大鼠的體重分別為232g和252g，通過尸檢發(fā)現(xiàn)，組1中死亡大鼠右側(cè)腦水腫明顯，蛛網(wǎng)膜下腔無出血，推測(cè)死亡原因?yàn)槟X梗急性期腦水腫導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，腦疝死亡;組2死亡大鼠取腦未發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及明顯腦水腫，可能死因與麻醉藥不耐受、窒息等因素相關(guān)。

2．神經(jīng)功能評(píng)分:術(shù)后2h對(duì)兩組大鼠行神經(jīng)功能評(píng)分，方差齊性檢驗(yàn)示數(shù)據(jù)不滿足方差齊性(F=15．825，P=0．001 ＜0．05)，選用校正 t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。組1神經(jīng)功能評(píng)分的均值為3．00±0．47，組2為1．80±1．32，差異具有顯著性(P ＜0．05)，且組 2 的標(biāo)準(zhǔn)差較大，神經(jīng)功能評(píng)分值離散程度高，大鼠個(gè)體之間的神經(jīng)功能評(píng)分的差異較大，不穩(wěn)定;組1中除1只死亡外，評(píng)分較一致，比較穩(wěn)定(圖1)。

3．腦梗死體積:組1大鼠取腦時(shí)右側(cè)腦組織明顯腫脹，右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的外側(cè)額、頂、顳部區(qū)域顏色蒼白，淺于左側(cè)正常組織，TTC染色可見大腦皮質(zhì)和紋狀體部明顯白色梗死灶;組2外觀腦腫脹不明顯，TTC染色示梗死灶多局限于紋狀體或無梗死灶(圖2)。兩組大鼠平均相對(duì)腦梗體積分別為23%、8%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖3)。

圖1 腦缺血2h后各個(gè)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分情況

圖2 兩組大鼠缺血再灌注24h后TTC染色情況

圖3 腦缺血再灌注24h后兩組大鼠的腦相對(duì)梗死體積比較

討 論

缺血性腦血管病以大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的血流阻塞最為常見，大鼠線栓法制備MCAO模型具有不開顱、損傷小，能準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間，梗死效果確切等特點(diǎn)，成為研究缺血性腦血管病的病理生理機(jī)制的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀?986年，Koizumi等［7］首次不開顱經(jīng)CCA栓入尼龍線閉塞大腦中動(dòng)脈獲得成功，后Longa等［1］于1989年對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)后，推廣此方法廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性腦缺血的研究。Longa等［1］在實(shí)驗(yàn)中采用的是4-0的單股尼龍手術(shù)線，把栓線頭端燒成球形，因其來源困難，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室常以同等直徑的魚線或尼龍線替代，由于制作工藝不一所致栓線頭端粗細(xì)不定，加之動(dòng)物的品系，體重及插入深度的不同，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性腦缺血灶的不穩(wěn)定。

本課題組在實(shí)驗(yàn)過程中購入線長40mm，線身直徑0．26mm，頭端直徑0．36mm并以多聚賴氨酸包被，在19mm處標(biāo)記黑點(diǎn)的消毒處理后的即用型尼龍栓線，根據(jù)使用說明適用于250～280g大鼠。但是在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段控制大鼠體重范圍260～270g，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型成功率較低。推測(cè)原因可能與大鼠品系和造模方法有關(guān)。隨后根據(jù)說明書調(diào)整，將大鼠體重降低10～20g，并分組造模，觀察此型號(hào)栓線適應(yīng)的大鼠體重。本研究發(fā)現(xiàn)體重范圍在238±6g(230～249g)的SD大鼠用此栓線能得到穩(wěn)定的MCAO模型，缺血2h再灌注24h后TTC染色顯示梗死灶明顯，神經(jīng)功能評(píng)分較一致且大鼠的死亡率較低(10%)。

另外，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，會(huì)遇到以下問題:(1)麻醉死亡或不完全:腹腔注射水合氯醛時(shí)誤將麻藥注入股靜脈、膀胱、腸腔或皮下，會(huì)導(dǎo)致麻醉死亡或不完全，將注射器刺入腹腔后，輕微回抽，無血無水阻力較小時(shí)再推進(jìn)麻藥，麻醉不全時(shí)可少量補(bǔ)加麻醉藥(約0.2ml)，減少因麻醉所致的死亡。(2)是否分離PA:PA位置較深，分離PA時(shí)對(duì)周圍的組織和神經(jīng)損傷較大，引發(fā)大鼠較劇烈的刺激反應(yīng)，耗時(shí)較長，故造模過程中不分離PA，可通過手法調(diào)整避開PA，將模型制備時(shí)間控制在15min左右。(3)栓線在閉塞大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)之前卡住:有兩種情況可以考慮，一為栓線頭部進(jìn)入PA，此時(shí)栓線插入深度約8mm，強(qiáng)行用力繼續(xù)易導(dǎo)致PA破裂，PA位置較深，出血難以止血導(dǎo)致大鼠死亡，可通過調(diào)整栓線方向和弧度，避開PA繼續(xù)向前。二為栓線頭部卡在ICA入顱處，此時(shí)栓線進(jìn)入約13mm，此情況較為少見，排除大鼠血管痙攣及調(diào)整栓線方向均阻力較大，若確保栓線不在PA，可酌情放棄手術(shù)，剔除該大鼠。(4)栓線插入深度:栓線進(jìn)入約18mm即可達(dá)到MCA入口，即可感覺有輕微阻力，不可忽略此阻力繼續(xù)推送，研究結(jié)果顯示，栓線插入過深可進(jìn)入MCA使其徹底閉塞，導(dǎo)致腦梗死面積范圍過大或血管壁破裂，導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，死亡率增加［6］。(5)栓線固定及拔出:栓線到達(dá)指定位置后由雙線固定且須松緊適度，太松大鼠清醒后易自行拔出引發(fā)ECA斷端出血形成血腫，太緊拔線栓時(shí)須二次打開傷口解開固定線拔栓線。大鼠清醒狀態(tài)下拔栓線易引起其劇烈掙扎，栓線易刺破血管膜引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血，或栓線全部拔出致血液經(jīng)ECA斷端流出，故麻醉后拔出栓線為佳。

通過實(shí)驗(yàn)研究筆者發(fā)現(xiàn)MCAO模型的成功制作與多種因素相關(guān)，最關(guān)鍵因素在于大鼠體重和選擇的所用栓線的規(guī)格的匹配。故筆者在實(shí)驗(yàn)中選擇購于公司的規(guī)格一致的栓線，以排除人工制作栓線引起的實(shí)驗(yàn)誤差。本研究結(jié)果顯示，體重范圍在238±6g的SD大鼠采用沙東2636－4A型號(hào)的栓線可得到穩(wěn)定的，可重復(fù)的MCAO模型，穩(wěn)定的動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，才能使基于該模型展開的實(shí)驗(yàn)研究所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。

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