郭東艷 王 幸 唐志書 汪鋆植

湖北海棠［Malus hupehensis(Pamp．)Rehd．］別名甜茶果、泰山海棠，為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物［1，2］。原產(chǎn)湖北省西部神農(nóng)架林區(qū)、宜昌、恩施等地，湖北海棠葉是湖北人常飲用的涼茶，也是土家族常用的藥物，收載于《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)，具有養(yǎng)肝和胃、生津止渴、消積化滯等功效，用于急慢性肝損傷、慢性肝炎、脂肪肝治療［3，4］。有關(guān)湖北海棠葉總黃酮文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)選湖北海棠總黃酮的提取工藝，以期為今后的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1．儀器:Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(G1311C型四元泵，G1329B型進(jìn)樣器，G4212B型二極管陣列檢測(cè)器);UV－1102型紫外可見分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司);GB－204型電子天平(瑞士);HH－2型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

2．試藥:湖北海棠葉［購(gòu)自湖北神農(nóng)架，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤老師鑒定為蘋果屬(Malus Mill．)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp．)Rehd］的干燥葉。根皮苷對(duì)照品(自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)含量＞98%);甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

3．湖北海棠葉中根皮苷的含量測(cè)定［6］色譜條件:Diamonsil C18(250．0mm ×4．6mm，5μm)色譜柱;乙腈 －0．05% 磷酸水(25∶75)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為287nm;流速為:1．0ml/min;溫度為30℃。(1)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取根皮苷對(duì)照品，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．015mg的溶液，備用。(2)供試品溶液的制備:精密移取湖北海棠葉提取液0．5ml于蒸發(fā)皿中于水浴上蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。線性關(guān)系的考察:精密移取根皮苷對(duì)照品溶液 2、4、6、8、10、12μl，依色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以根皮苷的含量(μg)為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。(3)含量測(cè)定:精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算根皮苷含量。

4．湖北海棠葉中總黃酮的含量測(cè)定［6］:(1)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取根皮苷對(duì)照品適量，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．1mg的溶液，備用。供試品溶液的制備:精密移取湖北海棠葉提取液1ml蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0．45μm微孔濾膜濾過，即得。(2)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:分別取根皮苷對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照紫外－可見分光光度法，空白試劑為50%甲醇，在選定的200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，分別對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果兩者均在287nm有最大吸收，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為287nm。

5．提取次數(shù)的考察:稱取4份湖北海棠葉約10．0g，分別加入10倍量70%的乙醇，水浴中回流提取1、2、3、4次，每次1h，濾過，將各濾液分別合并。以湖北海棠葉中根皮苷及總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選提取次數(shù)。

6．星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝:采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法以回流提取法提取湖北海棠葉，以總黃酮及根皮苷的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響提取效果的主要因素乙醇濃度(X1)、溶劑用量(X2)、提取時(shí)間(X3)進(jìn)行考察，從而確定回流提取的較佳工藝條件。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 14．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料用效應(yīng)面分析法及方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．湖北海棠葉中根皮苷線性范圍的考察結(jié)果:以根皮苷的含量(μg)為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為:Y=1745X+1．4467(R2=0.9999)，結(jié)果表明，根皮苷在 0．03 ～0．18μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．湖北海棠葉中總黃酮的含量測(cè)定:(1)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:通過對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果兩者均在287nm有最大吸收，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為287nm。(2)線性關(guān)系考察:分別精密吸取根皮苷對(duì)照品溶液 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0ml并移至10ml量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，即得。按紫外－可見分光光度法，以50%甲醇為空白，在287nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。吸收度(Y)為縱坐標(biāo)，根皮苷的濃度(X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程為 Y=30.274X+0．0055，R2=0．9993。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在0．005～0．03mg/ml濃度范圍內(nèi)與吸收度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3．提取次數(shù)的考察結(jié)果:以湖北海棠葉中根皮苷及總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選提取次數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 提取次數(shù)的考察(%)

結(jié)果表明，提取1次湖北海棠葉中總黃酮及根皮苷已基本提取完全，但為了避免試驗(yàn)中因誤差造成總黃酮及根皮苷提取不完全，因此確定提取次數(shù)為2次。

4．星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［7］:(1)以乙醇濃度(X1)、溶劑用量(X2)、提取時(shí)間(X3)為自變量，以湖北海棠葉中根皮苷(W1)及總黃酮百分含量(W2)的綜合評(píng)分為因變量，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。(2)模型擬合:采用 Design－Expert8．0．6軟件，以根皮苷及總黃酮百分含量的綜合評(píng)分對(duì)自變量進(jìn)行回歸和擬合，結(jié)果表明，r=0．9974，各項(xiàng)方差分析結(jié)果見表4，簡(jiǎn)化后的二項(xiàng)式方程為:Y=0．86+0.044X1－0．012X2+0．013X3－0．030X1X2+3．750 ×10－3X1X3+0.015X2X3－0.047X21+0.017X22+4．020 ×10－3X23，r=0．9956。說明 99．56% 總黃酮及根皮苷提取率的變差歸因于3個(gè)因素的變化，即只有0．44%的變差不被此方程所解釋。由表4的各個(gè)P值可以看出3個(gè)因素的線性效應(yīng)都有較高的顯著性(P＜0．01)。擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。(3)工藝優(yōu)化與預(yù)測(cè):固定其中一個(gè)因素值，繪制其中兩個(gè)因變量曲面圖(圖1～圖3)。在圖上選取較佳的工藝為:X1:68.88%，X2:8.54倍量，X3:148.2min。但考慮到實(shí)際的可操作性，修正工藝參數(shù)為乙醇濃度(X1):70%，溶劑用量(X2):8倍量，提取時(shí)間(X3):150min，并對(duì)其進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。稱取湖北海棠葉50．0g，共3份，各加8倍量70%乙醇，提取2次，每次150min，平行制樣。依法測(cè)定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的工藝提取所得實(shí)測(cè)值與理論值接近，偏差在3%以內(nèi)。因此可將該提取工藝修訂為加入8倍量70%乙醇，提取2次，每次 150min。(4)驗(yàn)證試驗(yàn):根據(jù)最優(yōu)工藝提取湖北海棠葉3份(每份500g)，依法測(cè)定總黃酮及根皮苷的含量，結(jié)果見表6。

表2 湖北海棠中總黃酮提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

表3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

表4 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

圖1 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

圖2 乙醇濃度與溶劑倍量對(duì)提取效果的影響

圖3 溶劑倍量與提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

表5 工藝優(yōu)化結(jié)果表

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(%)

討 論

近年研究表明，湖北海棠葉中主要含有茶多酚、黃酮、Zn、Cr、Mn等多種礦物質(zhì)等，其中黃酮類以根皮苷含量高，且易于提取分離。文獻(xiàn)［5～12］報(bào)道，湖北海棠葉中的總黃酮及根皮苷具有多種藥理活性，因此以總黃酮及根皮苷的含量作為湖北海棠葉提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有一定的科學(xué)性。

本試驗(yàn)通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)選所得的最佳提取工藝為加入8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次。與筆者前期通過正交試驗(yàn)優(yōu)選的結(jié)果稍有差異［5］(8倍量70%的乙醇，回流提取3次，每次1h)。為了驗(yàn)證提取工藝的可行性，實(shí)驗(yàn)中分別采用優(yōu)選的兩種工藝條件進(jìn)行提取，并進(jìn)行總黃酮及根皮苷的含量測(cè)定比較，結(jié)果兩種工藝提取出的總黃酮及根皮苷含量接近，8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次1h所得總黃酮及根皮苷含量較8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次的分別高3．2%和2.4%。關(guān)于大生產(chǎn)中工藝條件的選擇有待于通過總黃酮與根皮苷的提取率及生產(chǎn)成本進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)選擇。

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2 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志［M］．北京:科學(xué)出版社，1974:379－380

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5 王幸，師延瓊，覃鴻恩，等．多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法優(yōu)選湖北海棠葉中總黃酮提取工藝［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(13):46－49

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