唐 婧，包建玲，孟存仁，張朝霞

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，新疆烏魯木齊830054)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎呈全球分布，大約有1.7億人為HCV感染者，占世界人口的3%，且發(fā)展中國家高于發(fā)達國家[1]。丙型肝炎病毒抗體(抗HCV)是目前應用最廣泛的用于流行病學調查、臨床丙型肝炎患者篩查和診斷的檢測項目，為丙型肝炎的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了可靠的依據(jù)[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是抗HCV檢測最常用的方法。在免疫定性測定中，確定合適的陽性判斷值(Cut-off值)對減少假陽性和假陰性，確保試驗的敏感性和特異性具有重要意義[3]。研究表明受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線是設定 Cut-off值的最佳方法[4]。我們采用ROC曲線確定實驗室兩種不同酶免分析系統(tǒng)檢測抗HCV的最佳Cut-off值，以提高ELISA檢測抗HCV的敏感性和特異性。

材料和方法

一、研究對象

使用盲法收集2013年3月至2013年5月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心血清標本202份，分離血清，置－80℃保存待測。標本來源對象年齡1～82歲，男93例，女109例，其中132份來自肝病科門診和住院患者、70份來自普通門診患者和體檢者。

二、儀器與試劑

addcare ELISA 1100全自動酶免分析系統(tǒng)(簡稱ddcare ELISA 1100，煙臺生物科技有限公司);TECAN加樣系統(tǒng)(瑞士帝肯公司);FAME后處理系統(tǒng)(瑞士哈美頓公司)。抗HCV確證試劑盒[重組免疫印跡法(recombinant immunoblot assay，RIBA)]由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供(批號為RC20130101);抗HCV診斷試劑盒由(ELISA)北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供(批號為C20130406)。所有試劑均在有效期內使用，按說明書操作。

三、方法

1.標本檢測 對－80℃保存待測的202份血清標本分別用上述指定廠家的抗HCV診斷試劑(ELISA)和抗HCV確證試劑(RIBA)進行抗HCV測定和抗HCV確認，記錄吸光度(A)值，其中ELISA分別用addcare ELISA 1100和TECAN+FAME組合酶免分析系統(tǒng)(簡稱TECAN+FAME酶免系統(tǒng))進行檢測。檢測前兩種系統(tǒng)均進行了校準和性能驗證。

2.RIBA確認結果判定 條帶強度的判讀和結果的解釋見表1和表2。

表1 RIBA抗HCV反應條帶強度的判讀標準

表2 RIBA抗HCV反應結果的判讀標準

3.質量控制 ELISA檢測每一批分別設定2個陰性對照、2個陽性對照和1個質控，其中陰性對照孔A值≤0.08，陽性對照孔A值≥0.50，否則實驗無效，質控孔S/CO值在2.39～4.96的范圍內。RIBA檢測每一批分別設定1個陰性對照和1個陽性對照，其中陰性對照出現(xiàn)對照線-1和對照線-2，陽性對照出現(xiàn) Core、NS3、NS4-1、NS4-2、NS5、對照線-1和對照線-2，且每條試驗結果中對照線-1和對照線-2均必須出現(xiàn)，如果對照線-1和對照線-2均不出現(xiàn)或僅出現(xiàn)1條，則此條的檢測結果無效。試驗均有良好的質量控制。

4.Cut-off值的驗證 EP12-A文件Cut-off值的驗證方法:(1)準備具有臨界值濃度和濃度在臨界值±20%的標本，標本的量要充足，以保證同一份樣本能重復測定20次;(2)重復測定每個標本20次，計算出每個標本的陰性和陽性百分比;(3)估計的臨界值是否準確，如果準確，同一份樣本重復測定的結果應該有50%陽性和50%陰性結果;(4)臨界值±20%的濃度范圍是否位于該實驗方法的“95%區(qū)間”，當臨界值+20%濃度的標本檢測陽性率≥95%，且臨界值－20%濃度的標本檢測結果陰性率≥95%，則該濃度范圍≥該方法95%區(qū)間;此時，標本濃度在臨界值±20%濃度范圍之外就能得到穩(wěn)定的檢測結果。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。用抗HCV A值做ROC曲線，計算曲線下面積，并探討其最佳臨界值即約登指數(shù)最大時的Cut-off值，且約登指數(shù)為敏感性與特異性之和減去1，從而確定抗HCV診斷價值最大時的Cut-off值。用配對四格表卡方檢驗探討ROC曲線確定的兩種不同酶免分析系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV最佳Cut-off值下的檢測結果的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、RIBA確認檢測結果

RIBA檢測結果為陽性142份，陰性60份。其中142份RIBA陽性標本5個抗原區(qū)條帶強度分布情況見表3。142份RIBA陽性標本中，Core蛋白、NS3蛋白、NS4-1蛋白、NS4-2蛋白和NS5蛋白陽性的分別有142份、141份、80份、16份和68份，其中強度為2+的分別有125份(88%)、121份(85%)、61份(43%)、9份(6%)和 56份(39%)，強度為1+的分別有17份(12%)、20份(14%)、19份(13%)、7份(5%)和12份(8%)。

表3 142份RIBA陽性標本5個抗原區(qū)條帶強度分布情況

二、ROC曲線分析結果

以RIBA檢測結果為參照，繪制兩種酶免分析系統(tǒng)不同陽性判斷值的ROC曲線。addcare ELISA 1100檢測抗 HCV的最佳 Cut-off值為0.448，敏感性為 99.3%，特異性為 96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線下面積為 0.998，見圖 1。TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測抗HCV的最佳Cut-off值為 0.406，敏感性為 99.3%，特異性為96.7%，約登指數(shù)為 0.960，ROC 曲線下面積為0.998，見圖2。兩種系統(tǒng)不同臨界值時的敏感性和特異性見表4和表5。對比兩種系統(tǒng)采用ROC曲線確定的最佳Cut-off值下的抗HCV檢測結果，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)。見表6。

圖1 addcare ELISA 1100檢測抗HCV的ROC曲線圖

圖2 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測抗HCV的ROC曲線圖

表4 addcare ELISA 1100不同臨界值下的敏感性和特異性

表5 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)不同臨界值下的敏感性和特異性

表6 兩種系統(tǒng)檢測抗HCV的最佳Cut-off值下的檢測結果 (例)

三、Cut-off值的驗證結果

addcare ELISA 1100檢測抗HCV的最佳Cutoff值為0.448。一個 A值約為0.448的標本重復測定20次獲得50%陽性結果和50%陰性結果。一個A值約為0.538(臨界值+20%)的標本重復測定20次獲得的陽性率為95%。一個A值約為0.358(臨界值－20%)的標本重復測定20次獲得的陰性率為100%。

TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測抗HCV的最佳Cut-off值為0.406。一個A值約為0.406的標本重復測定20次獲得50%陽性結果和50%陰性結果。一個A值約為0.487(臨界值+20%)的標本重復測定20次獲得的陽性率為95%。一個A值約為0.325(臨界值－20%)的標本重復測定20次獲得的陰性率為100%。

討 論

ELISA是目前臨床檢驗中應用較為廣泛的一種檢測方法，其判斷測定結果的依據(jù)主要依靠所謂的“陽性判斷值”，即Cut-off值。雖然各廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒均提供Cut-off值的計算方法，但不同批試劑盒使用相同Cut-off值。多年使用同一Cut-off值的現(xiàn)象普遍存在，這顯然存在不合理性。由于試劑盒生產(chǎn)工藝的不均一性，各批試劑盒的反應效果不盡相同，所得的Cut-off值應當不同。此外，環(huán)境溫度、加樣體積誤差、洗板效果等方面均是影響ELISA檢測性能的因素。為此，各實驗室需自行設定并計算適合本實驗室的Cutoff值[5]。

本研究中的兩種系統(tǒng)(addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系統(tǒng))雖然使用同一種抗HCV診斷試劑盒，但是addcare ELISA 1100是加樣、后處理一體機，有2個工作艙(前、后艙自動轉板，避免污染)和3臺獨立洗板機(前后艙均可使用，每臺洗板機均為96針洗板頭，洗板強度大、效果好)，開放操作(易受環(huán)境溫度干擾);TECAN+FAME酶免系統(tǒng)是TECAN加樣系統(tǒng)和FAME后處理系統(tǒng)組合的酶免分析系統(tǒng)，人為轉板，易污染，2臺洗板機(每臺洗板機均為24針洗板頭，洗板效果較差)，后處理機內部操作(受環(huán)境溫度干擾小)。針對以上不同點，本實驗室有必要分別確定兩種系統(tǒng)ELISA各自的檢測抗HCV的Cutoff值。

Cut-off值的設定方法一般有標準差比率、測定標本對陰性比值、以陰性對照均值±2s或3s、百分位數(shù)法、雙質控、ROC曲線等[4]。不同的方法設定的Cut-off值有一定的差異，但都要綜合考慮假陽性率和假陰性率。在各種Cut-off值的計算方法中，ROC曲線法已得到了實驗室的認可[6]。該方法考慮了每一個可能的Cut-off值，因而能夠更客觀地評價診斷試驗的診斷價值和確定最佳臨界值。

本研究通過ROC曲線確定addcare ELISA 1100檢測抗HCV的最佳Cut-off值為0.448，敏感性為 99.3%，特異性為 96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線下面積為0.998;TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測抗HCV的最佳Cut-off值為0.406，敏感性為99.3%，特異性為96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線下面積為0.998。

伍建寧等[7]研究通過對5 709份無償獻血者標本的抗HCV ELISA檢測的A值的統(tǒng)計和RIBA檢測，確認Cut-off值以0.112為宜，與本研究所確定的Cut-off值(0.448和0.406)相差較大。其原因可能有:(1)Cut-off值的設定方法不同，伍建寧等[7]的Cut-off值的設定方法為百分位數(shù)法單側99%，本研究Cut-off值的設定方法為ROC曲線法;(2)儀器與試劑不同，伍建寧等[7]使用Genesis RSP-200型全自動標本處理系統(tǒng)加樣，德國BEPⅢ全自動酶標儀進行后處理及檢測，本研究分別使用 addcare ELISA 1100和 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測，伍建寧等[7]研究抗 HCV ELISA測定試劑盒購自廈門新創(chuàng)生物工程公司，抗HCV RIBA 3.0SIA確認試劑盒購自美國Chiron公司，本研究抗HCV ELISA測定試劑盒和抗HCV RIBA確認試劑盒均購自同一家公司;(3)標本來源不同，伍建寧等[7]研究標本來自5 709份無償獻血者，本研究標本來自202份臨床檢測者。采供血系統(tǒng)血液篩檢抗HCV，Cut-off值的設定應略低于臨床抗HCV檢測，這對于減少HCV的經(jīng)輸血傳播具有重要意義[7]。

抗HCV診斷試劑盒說明書上提供的Cut-off值的計算公式為臨界值=陰性對照孔A均值+0.12(不足0.02按0.02計算)。因此通常情況下所計算出的Cut-off值為0.140，與本研究所確定的Cut-off值(0.448和0.406)相差較大。若按照說明書上提供的Cut-off值判斷陰性和陽性標本，雖然敏感性較高，但是特異性較低，即易出現(xiàn)假陽性。再者，由于ELISA方法學上的缺陷，抗HCV檢測出現(xiàn)假陽性的原因有:(1)高球蛋白血癥[4];(2)類風濕因子(RF)的干擾，如血清或血漿標本中存在RF，則其可與固相上的IgG和酶標記的IgG結合，從而出現(xiàn)假陽性反應;(3)標本中超氧化物歧化酶的干擾;(4)用于固相包被的HCV基因工程抗原不純[8];(5)試劑保存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)的影響[9]。因此會增加臨床抗HCV檢測的誤診率。若按照本研究確定的Cut-off值判斷陰性和陽性標本，雖然敏感性降低，但是特異性升高，即易出現(xiàn)假陰性。抗HCV檢測出現(xiàn)假陰性的原因有:(1)HCV感染后到抗體的出現(xiàn)有一個較長的窗口期(平均為6～12周)[10];(2)HCV 感染的其它階段。因此會提高臨床抗 HCV檢測的漏診率。ELISA技術本身在Cut-off值的設置上存在局限性，也就是說在Cut-off值周圍一定區(qū)域內，測定結果難以明確判斷是陰性還是陽性，即所謂的灰區(qū)，而這個灰區(qū)到底有多大，在國內使用的ELISA試劑盒中均無說明。這種一刀切的判斷方式所得到的結果存在假陰性的可能[7]。

綜上所述，雖然從理論上而言，ROC曲線是設定Cut-off值的最佳方法，但是由于ELISA測定通常有較大的變異，其每次測定的Cut-off值都會有所差異，因此需要控制Cut-off值的批間變異，但在實際應用中有一定的局限性[3]。因此，綜合抗HCV診斷試劑盒說明書上提供的Cut-off值(0.140)和經(jīng)ROC曲線確定的兩種系統(tǒng)的Cut-off值(0.448和 0.406)的診斷性能，將本實驗室addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測抗HCV的“灰區(qū)”分別設定為0.140～0.448和0.140～0.406。對于ELISA檢測抗HCV中的“灰區(qū)”結果，最好采用較為敏感和特異的方法進行復檢，以免誤診和漏診。有條件的實驗室可以用確認試驗對結果進行確認。

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