徐偉紅，徐 斌，范列英

(1.同濟大學醫(yī)學院，上海200092;2.上海同仁醫(yī)院，上海200050;3.同濟大學附屬東方醫(yī)院，上海200040)

醫(yī)院感染爆發(fā)的定義是在短時間內發(fā)生3例以上同種同源感染病例的現象。對同種同源病例的定義，臨床大多以細菌耐藥菌譜作為同源性分析的依據，一直以來缺乏有效、實用、適用的實驗室監(jiān)測手段。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥株感染率近年來快速上升，除了與抗菌藥物的濫用有關，還與菌株的克隆傳播有很大關系[1]。我們收集了上海同仁醫(yī)院臨床分離的38株MRSA，采用mecA基因相關高變區(qū)(mecA gene related hyper-variable region，HVR)多態(tài)性分析對其進行分型，了解其多態(tài)性分布狀況，為醫(yī)院感染爆發(fā)的確立提供實驗室依據。

材料和方法

一、材料

1.標本來源 38株MRSA菌株均來源于2013年7月至2013年9月上海同仁醫(yī)院的住院患者，非重復菌株。其中來自痰標本20株、咽拭子9株、尿液4、膽汁3株、膿液和導管各1株。

2.實驗儀器及試劑 VITEK 2-COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)及其配套的GP67藥敏板為法國梅里埃公司產品;血平板和MH平板購自上海伊華生物公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海之江生物公司;聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑 Takara TaqTMHot Start Version購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker(100 bp ladder)購自北京TIANGEN生物技術有限公司;金黃色葡萄球菌 HVR-PCR引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。Veriti 96-Well PCR擴增儀為ABI公司的產品;凝膠成像儀為TANON公司產品。

二、方法

1.細菌鑒定及藥敏 所有菌株均經VITEK 2-COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定及體外藥敏分析。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC29213。

2.細菌DNA的提取 嚴格按上海之江生物公司生產的細菌基因提取試劑盒說明書操作。

3.PCR引物 HVR引物序列根據文獻[2]。引物序列:P1為5’-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3’，P2 為 5’-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3’。

4.MRSA的HVR-PCR分型 取MRSA的菌株基因組DNA 1μL作為擴增的模板，加入PCR反應體系:HVR-PCR引物0.2μL(引物濃度為10 mmol/L)，10×PCR buffer 1μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8μL，Taq 聚合酶0.05μL，滅菌去離子水6.95μL，反應總體積為 10μL。PCR 反應條件:94℃預變性1 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，35個循環(huán);72℃延伸4 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中進行分析。

結 果

一、MRSA的HVR-PCR分型結果及HVR基因型的分布

MRSA的HVR-PCR產物經電泳后可觀察到4種不同條帶，見圖1。根據這些條帶的不同(PCR產物片段大小)，38株MRSA被分為A、B、C、D 種基因型，其中以 C型23株(60.53%)，A型7株(18.42%)、B 型3 株(7.89%)、D 型2 株(5.26%)、未分型 3 株(7.89%)。C 型在各臨床科室均有分布，主要集中于老干部科。A、B、D和未分型則隨機分布在各臨床科室。見表1。

表1 MRSA的HVR基因型在各科的分布

圖1 MRSA的HVR-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

二、MRSA的藥敏結果

MRSA對苯唑西林、青霉素的耐藥率為100%，對紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率均在80%以上。對奎奴普汀/達福普汀、替加環(huán)素、萬古霉素的敏感率為100%，對利福平的敏感率為89.5%，利奈唑烷的敏感率為81.6%。見表2。

表2 MRSA對常用抗菌藥物的耐藥情況

討 論

由于MRSA抵抗力和毒力均較強，常存在多重耐藥，伴隨近年來分離率的增加，更被重視。在控制醫(yī)院感染方面，MRSA已經成為主要的引起暴發(fā)流行的致病菌，因而尋找傳染源、切斷傳播途徑顯得尤為重要[3]。

MRSA是指表達mecA基因或具有其它耐藥機制如青霉素結合蛋白與苯唑西林的親和力改變的金黃色葡萄球菌[4]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌特有的[5]，而HVR與該基因緊密相連，存在于其下游，也具有特異性。mec基因高變區(qū)的dru序列是位于mecA與IS431 mec之間、長約2 040 bp的片段，由一個40 bp的片段重復1～9次構成。在不同的MRSA菌株中dru重復次數不同，決定了MRSA基因的多態(tài)性，成為基因分型的分子基礎。本研究根據HVR長度多態(tài)性將38株MRSA分為4型，其中以C型多見(60.53%)，A 型7 株(18.42%)、B 型 3株(7.89%)、D 型 2株(5.26%)、未分型 3 株。王敏等[6]報道，用HVR-PCR方法將 MRSA按大小分為200、410、470、510及 600 bp共 5型，其中以 510 bp(61.25%)及 600 bp(21.25%)多見。曹鴻霞等[7]將安徽地區(qū)部分醫(yī)院分離的73株MRSA電泳后發(fā)現470～600 bp的3種基因型，以600 bp(58.8%)多見。說明MRSA的流行存在地區(qū)差異。本研究未發(fā)現200 bp的菌株，也可能是實驗菌株較少的原因。同時本研究結果顯示MRSA呈嚴重且多重耐藥，對苯唑西林、青霉素的耐藥率100%，對紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率都在80%以上。故首選抗生素治療藥物為萬古霉素、替加環(huán)素、奎奴普汀/達福普汀和替考拉寧。

MRSA主要通過接觸傳播，很容易在醫(yī)院環(huán)境內流行，常可造成局部地區(qū)的爆發(fā)流行。因此本研究選擇了3個月內分離的所有的MRSA菌株，結果發(fā)現A型分離出7株，在醫(yī)院內呈散在分布;C型分離出23株，為本院MRSA流行株的優(yōu)勢型別，各科室流行株之間具有高度同源性，提示科室之間存在交叉感染現象，應引起高度重視。C型集中于干部病房，表明MRSA菌株在干部病房內存在克隆傳播。這與干部病房特殊的住院時間、用藥特點及環(huán)境的交叉感染有關[9]。

利用PCR技術對MRSA進行分型的常用方法有隨機引物PCR、擴增片段長度多態(tài)性、特異功能集團基因的多態(tài)性等分型方法[10]。mecA基因HVR長度多態(tài)性分型屬于特異功能集團基因的多態(tài)性分型方法，只適合于MRSA菌株。本研究發(fā)現mecA基因HVR長度多態(tài)性分型在分型率、分辨力及結果上都較為可靠，可以為控制金黃色葡萄球菌感染提供詳實的流行病學資料，值得推廣。在MRSA流行病學研究中，往往會把幾種方法聯(lián)合使用，對MRSA的流行病學分析往往會更加準確。

綜上所述，醫(yī)院應采取嚴格的院內感染控制措施，防止MRSA耐藥株在醫(yī)院不同病區(qū)內的轉移。同時應積極開展簡便、快速的MRSA分型檢測，尋找感染來源，對阻斷MRSA在醫(yī)院內的爆發(fā)流行有重要的臨床意義。

[1]吳 晶，應春妹，汪雅萍，等.金黃色葡萄球菌耐藥性監(jiān)測分析[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2011，31(12):1754-1757.

[2]Senna JP，Pinto CA，Carvalho LP，et al.Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and PCR analysis of polymorphisms on the mec hypervariable region for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol，2002，40(6):2254-2256.

[3]王 輝，陳宏斌.甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的實驗室診斷[J].中國感染與化療雜志，2011，11(6):420-422.

[4]李春兒，林奇龍，陳瓊娜.2010至2012年金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染的臨床分布及耐藥性變遷[J].檢驗醫(yī)學，2013，28(6):560-562.

[5]喬 昀，陳君灝，羅云桃，等.醫(yī)院感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌基因分型研究[J].檢驗醫(yī)學，2012，27(12):1031-1034.

[6]王 敏，李先平，李文娟，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌高變區(qū)基因分型研究及其與耐藥性的關系[J].中華微生物學和免疫學雜志，2009，29(2):108-112.

[7]曹鴻霞，熊自忠，王中新，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌HVR基因分型[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2008，18(1):8-10.

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